DHPLC联合一代测序技术在脊髓肌萎缩症携带者筛查中的应用

刘春苗 孟雁欣 张志敏 杨扬 王亚男 张海娟

脊髓肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)因脊髓前角α-运动神经元退化变性引起的一组以缓慢进行性加重肌无力、肌萎缩为主要临床特征的常染色体隐性遗传性骨骼肌疾病，继杜兴型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)之后第二常见婴幼儿致死性骨骼肌遗传病[1,2]。研究指出 95% 因 SMN1 纯合缺失(“0+0”型)致病，5% 因SMN1复合杂合突变(“0+1”型)致病[3]。部分研究证实白种人群中存在双等位基因均为微小变异致病[4]。因此，SMN1双等位基因致病性变异作为SMA发病机制，也是诊断SMA金标准。SMN2与SMN1序列具有高度同源性且均分布在5q13.2，作为公认的SMA修饰因子，研究指出患者携带 SMN2 拷贝数越多表型越轻，尽管其与表型的相关性不完全一致，但国内外SMA管理共识中仍将SMN2 拷贝数作为 SMA 诊断的标准步骤之一[5]。全美医学遗传学会(american college of medical genetics,ACMG)早在2008年即推荐将SMA携带者/产前筛查纳入常规孕前检查项目，并建议对高风险夫妇妊娠胎儿进行产前诊断或植入前诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)[6]。本研究基于SMA分子致病特征，将高效液相色谱技术(DHPLC)作为SMN1/SMN2拷贝检测手段，同时联合一代测序技术对患者序惯性进行点突变检测，以证实DHPLC联合一代测序技术在脊髓肌萎缩症携带者/产前筛查中有重要临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年1月至2019年1月因孕前筛查于石家庄市第四医院产前诊断中心就诊患者3 544例，其中男1 399例，女2 145例。签署知情同意书，抽取外周血3 ml。

1.2 分子生物学分析

1.2.1 DNA提取、PCR扩增：抽取3 ml外周血，天根DNA提取试剂盒获得基因组DNA，NanoDrop1000微量核苷酸蛋白多功能酶标仪(美国Gene公司)定量分析(OD260/OD280比值1.8～2.0)，-80℃保存余DNA样本。Prime 6 软件设计引物，覆盖SMN1/KRIT1/CYBB全长，包括目的基因片段各个外显子及与内含子交界区，Pubmed blast比对引物。KRIT1/CYBB为内参基因。PCR扩增参数：95℃ 10 min热启动预变性，95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 60 s，共25个循环，72℃充分延伸 10 min。2% 琼脂糖凝胶电泳，100 V，30 min。见表1。

表1 PCR扩增片段及引物序列

1.2.2 DHPLC分析：样本完成PCR扩增进行DHPLC检测。5 μl PCR 反应样本上机(美国环球基因公司)，选择类型DS Multiple Fragment，温度50℃，上样、洗脱。应用仪器自带软件计算SMN1/KRIT1比值，SMN1/KRIT1等于0纯合缺失，杂合缺失或携带为0.5，正常人为1。以SMN1/KRIT1 比值作为校正系数，所有比值按照校正系数进行比对后得出数据。

1.2.3 SMN1 测序分析：美国ABI 3730XL(Applied Biosystems,Foster City,CA)自动测序仪测序。Sequencher v4.90 (Gene Codes,Ann Arbor,MI,USA) 比对分析，致病变异位点进行家系成员靶向检测分析。分析变异序列与疾病表型有无共分离现象，进行基因变异位点定位、明确氨基酸变化及功能改变。

2 结果

2.1 3 544 DHPLC结果 3 544例携带者检测样本中，共检测出63例携带者，包含男33例，女30例，拷贝缺失携带者检出率1.78%。我们进一步对63例SMA携带者配偶进行SMN1检测，测得SMN1变异11例。SMN1缺失变异携带者9例(SMN1∶SMN2=1∶1)，SMN1转换成SMN2 2例(SMN1∶SMN2=1∶3)。见图1。

图1 DHPL检出SMN1缺失携带者；A SMN1∶SMN2为1∶1;B SMN1∶SMN2为1∶2; D SMN1∶SMN2=1∶3; SMN1∶SMN2=1∶0

2.2 Sanger测序结果 SMN1 缺失分析检测后，对3 544 例样本进行SMN1 靶向测序分析，通过分析明确2例样本为SMN1点突变变异携带者。经Sequence 4.90及NCBI数据库比对分析证实1例为p.Q164X为致病突变携带者，对其配偶分别进行SMN1拷贝缺失及点突变检测未见异常。余1例为5号内含子位置SNP位点，数据库比对无显著致病意义。其他3 542例被检样本未检出致病意义明确变异位点。见表2，图2、3。

表2 受检人群、配偶及产前诊断胎儿 SMN1∶SMN2 基因型统计 例

图2 SMN1 exon4发生:p.Q164X(C>T)变异，编码氨基酸碱基提前终止

图3 SMN1 5 号内含子 (第5外显子下游 59 位：基因组(Hg19)为：chr 5:70,240,639)存在 1 个 SNP(rs754465849)

2.3 产前诊断检测结果 夫妇双方知情同意并签署知情同意书后，我们对11对夫妇双方均为SMN1携带者胎儿于孕18周进行胎儿羊水染色体检查。测得2例胎儿SMN1纯合缺失，即SMA患者，1例胎儿缺失变异携带者SMN1∶SMN2=1∶1，1例胎儿为SMN1(p.Q164X)变异点突变携带者。余胎儿检出结果未见异常。后期随访过程中，我们分别对11例高危胎儿随访，2例SMN1纯合缺失胎儿夫妇选择双方终止妊娠。余胎儿分娩后未见显著异常。

2.4 不同SMN1∶SMN2基因变异携带者比较 不同SMN1∶SMN2比例携带者进行统计学比较，证实SMN1∶SMN2=1∶1最为常见，与其他组别比较具有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 不同SMN1∶SMN2基因变异携带者检出率比较 n=78,例(%)

3 讨论

3.1 DHPLC应用于SMA携带者筛查中的优势 SMA是婴幼儿死亡最常见常染色体隐性神经骨骼肌遗传疾病，临床多依据临床表型、心肌酶、肌电图及骨骼肌活检进行初步诊断，由于缺乏特异性表型特征而多出现误诊、漏诊等情况[7]。与临床诊断依据比较，SMA基因检测因特异性强且取材方便的特征，逐渐被广大临床医生及受检者接受。迄今，已报道的SMA基因检测方法众多，如最早的单基因靶向测序技术、多重连接依赖性探针扩增技术(MLPA)、短片段多重定量PCR(QMMPSF)、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、聚合酶链式限制性长度多态性分析技术(PCR-RFLP)、变性DHPLC等分子检测技术，此外，近年高分辨溶解曲线技术(HRMA)及液相微珠阵列技术(liquid microbead arrays)等也逐步开始应用于临床检测分析[8-10]。已知的上述技术手段不同程度的存在消耗成本高、耗时、点突变变异不灵敏、漏诊、误诊率高等问题，因此很难完全在临床广泛开展。

DHPLC技术作为高通量、自动化基因突变检测技术极具代表性，最早多应用于癌症靶点、药物研发等领域，与其他测序技术相比较，不需要制备凝胶，且具备全自动、高效、快速、准确、省时省力、成本低等特点。伴随分子技术向临床应用的广泛转化，DHPLC技术逐渐应用于小片段外显子缺失检测。本研究应用DHPLC对3 544例样本进行SMA携带者筛查，共检出61例缺失变异携带者，检出率约为1.72%。既往研究指出SMA携带者基因型变异主要分4种：[0+1]型、[2+0]型、[1+1d]及[2+1d]型，肯定携带者人群中以[1+0]型最为常见，即一条染色体SMN1等位基因正常而另一条染色体SMN1缺失的等位基因最为常见[10]。我们检出的携带者中均为[0+1]型，这与既往龚波章等[11]报道一致。

SMN1与SMN2碱基序列同源性高达 99%,由于二者且均分布在5q13.2，因此SMN1与SMN2间基因拷贝数可以相互转化并参与SMA疾病表型，即SMN2拷贝数增加可以减轻SMA临床表型[12]。通过检测SMN1及SMN2 拷贝数可从基因型及临床表型两方面综合评估SMA形成缘由及临床表型严重程度，而SMN1及SMN2 拷贝数变异比值的明确也可为遗传咨询提供依据。DHPLC技术除定性分析外，亦能通过确定SMN1与SMN2比值进行定量分析。我们研究中61例拷贝缺失变异携带者中，31例SMN1∶SMN2 =1∶1，11例 SMN1∶SMN2 =1∶2。DHPLC还明确检测出17例携带者为SMN1转换成SMN2(SMN1∶SMN2=1∶3)及2例携带者SMN1∶SMN2=1∶0。

基于上述携带者检测基础，我们同时对61例缺失携带者配偶进行SMN变异检测，测得11例SMN1变异[9例(SMN1∶SMN2=1∶1]；2例(SMN1∶SMN2=1∶3)。以DHPLC对上述夫妇双方均为携带者高危胎儿进行SMN检测分析，检测结果证实2例胎儿为SMN1 纯合缺失，1例胎儿缺失变异携带者SMN1∶SMN2=1∶1。由此不难发现DHPLC对SMA携带者筛查或产前诊断均有重要意义，可有效减少相关患儿的出生[13]。

3.2 DHPLC联合一代测序技术检测应用于SMA携带者筛查的必要性及优势 SMA 患者95%因SMN1外显子7/8纯合缺失致病，5% SMN1点突变与缺失复合杂合致病[14]，提示点突变检测对SMN必不可少。尽管DHPLC对拷贝缺失变异检测极为灵敏，但技术上仍有不足之处，如对PCR要求高，不能直接检测出纯合突变，只能提供个体样本无突变信息，但无法得出具体突变类型。因此，对点突变变异检测常会出现漏诊或误诊的可能[15]。一代测序技术作为单基因疾病诊断的“金标准”，以单基因单变异作为检测靶点，检测灵敏度、特异性毋庸置疑，且同样具备省时低成本的优势[16]。本研究技术联合中依据SMA分子致病特点，选择一代测序技术作为联合方法对样本进行SMN1点突变变异分析。研究检出1例样本携带SMN1 p.Q164X，1例样本发生SMN 1 多态性变异位点。因此本研究共计检出62例SMA携带者，DHPLC与一代测序技术的联合使携带者检出率由1.72%提高至1.75%，一定程度上提高了SMA携带者检出率。我们以同样的技术联合方式对夫妇双方均为携带者的高危胎儿进行SMA产前诊断筛查，测得2例胎儿为SMA患者及2例携带者[1例胎儿缺失变异携带者SMN1∶SMN2=1∶1，1例胎儿为SMN1(p.Q164X)变异点突变携带者]。再次提示SMA携带者筛查的重要性及技术联合的必要性。

3.3 河北地区SMN1携带者变异特征 研究数据指出SMA人群携带率1/100～1/45，亚洲人群携带率约1/48，SMA患者同胞携带率为66.67%，发病无性别差异[2]。本研究3 544例样本共计检测出62例(61例缺失变异带+1例点突变变异)SMN1变异为致病携带者，人群携带率约1.75%，与我国宋昉[4]报道北方人群1/60携带率一致。但低于既往报道的上海、香港、台湾等南方地区人群携带率，提示SMA除具有较高人群携带率外还存在较强的南北地区差异性[17]。我们检出62例携带者中约98.38%为缺失携带，男女比例1∶1,证实河北地区SMA携带不存在男女性别差异。

综上所述，SMA分子诊断对于预防及减少此类患儿出生有重要意义，规范、精准SMA携带筛查流程建立可有效降低缺陷患儿出生，也是实现SMA二级预防的有效途径。同时技术联合可显著提高SMA携带者/患者检出率，有效减少临床误诊、漏诊。