石上柏乙酸乙酯萃取物下调LINC02474抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

高丽丽 陈会娟 王玲

随着人们生活方式的改变，结直肠癌(CRC)发病率呈迅速上升趋势，是全球范围内第四大致命恶性肿瘤[1]。目前，临床上对于早期CRC患者主要采用手术切除治疗，但大部分CRC患者在确诊时已处于晚期或发生转移失去手术机会。化疗、放疗和靶向治疗的应用显著改善了CRC患者的生存现状，但仍带来严重的副作用和不良反应。因此，寻找高效、安全、低毒的治疗方法是CRC临床研究的重要课题。石上柏为卷柏科卷柏属植物深绿卷柏的全草，具有清热解毒、抗癌、止血等功效，现广泛应用于肝炎、肺炎和风湿病等的治疗[2]。多项研究证实，石上柏对喉癌、鼻咽癌、肝癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤具有显著的抗肿瘤作用，但其对结直肠癌的防治作用鲜有报道[3-6]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度200个核苷酸的非编码RNA，其通过在转录、转录后、染色质修饰和基因组印记水平调节基因表达，参与细胞周期、细胞分化、转移等多种生物学过程，是肿瘤治疗的重要靶标[7]。长基因间非编码RNA 02474(LINC02474)位于染色体1q41，现有研究显示结直肠癌组织LINC02474表达上调，LINC02474高表达与结直肠癌发生、发展和预后密切相关[8,9]。本研究从细胞增殖、周期分布、迁移和侵袭角度研究了石上柏在CRC中的抗肿瘤作用，并检测LINC02474表达变化，以期为开发石上柏用于防治CRC奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人结直肠癌细胞Caco-2、DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素双抗购自武汉普诺赛生命科技公司；空载体质粒(pcDNA)、LINC02474过表达质粒(pcDNA-LINC02474)购自上海生工生物公司；细胞周期检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；Transwell小室和基质胶购于美国Millipore公司；PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq II购于大连宝生物科技公司；兔源上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)多克隆抗体、兔源神经钙黏素(N-cadherin)多克隆抗体、兔源磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、山羊抗兔IgG二抗购于上海碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 石上柏乙酸乙酯萃取物制备:参考黄茹意等[3]方法制备石上柏乙酸乙酯萃取物。取500 g干燥石上柏，粉碎后等量分装于两个圆底烧瓶中，按照料液比1∶8加入70%乙醇，85℃回流提取2 h，回流提取3次后，合并提取液，过滤，经旋转蒸发器浓缩得乙醇浸膏。用200 ml水复溶乙醇浸膏，用等体积乙酸乙酯萃取3次，浓缩干燥萃取液即为石上柏乙酸乙酯萃取物。用1 ml二甲亚砜溶解100 mg石上柏乙酸乙酯萃取物，4℃保存备用。

1.2.2 细胞培养和实验分组:Caco-2细胞采用含20%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM培养基于CO2体积分数为5%的37℃细胞培养箱中培养。细胞80%汇合时，按照1:4比例转移至新的培养皿，每隔1 d 换液1次，取对数期细胞用于后续实验。将Caco-2细胞接种96孔板，细胞贴壁后用石上柏乙酸乙酯萃取物终浓度分别为0、7.5、15.0、30.0 μg/ml的DMEM培养基孵育细胞48 h，依次记为对照组、石上柏-低、石上柏-中、石上柏-高组。为证石上柏的抗肿瘤作用与调控LINC02474表达有关，利用Lipofectamine 2000将pcDNA、pcDNA-LINC02474分别转染融合度为50%的Caco-2细胞，48 h后用含30.0 μg/ml石上柏乙酸乙酯萃取物的DMEM培养基孵育细胞48 h，依次记为石上柏-高+pcDNA组、石上柏-高+pcDNA-LINC02474。

1.2.3 集落形成实验检测细胞克隆能力:每组取2 ml单细胞悬液(细胞数约为3×102)接种到6孔板中，轻轻振动培养板，使细胞均匀扩散，并置于常规细胞培养箱中培养细胞14～21 d。当观察到可见细胞时终止培养。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，10%甲醇和10%乙酸固定细胞，0.4%的结晶紫染色。显微镜下计数>50个细胞的集落。

1.2.4 流式细胞术检测周期分布:用胰酶消化各组细胞，1 200 r/min离心5 min弃去培养基。PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心5 min后收集细胞。用预冷的70%乙醇4℃固定细胞12 h，PBS洗涤细胞2次，加入RnaseA室温避光孵育细胞30 min。加入碘化丙啶染色1 h后，流式细胞仪分析细胞周期分布。

1.2.5 Transwell实验检测细胞侵袭:每组取200 μl细胞悬液(细胞约为1×104，不含胎牛血清)接种涂有基质胶的Transwell小室中；将含有20%胎牛血清的培养基加入到24孔板下室作为诱导剂。将Transwell装置至于培养箱中孵育24 h后，去除Transwell膜上表面的基质胶和细胞，甲醇固定Transwell膜下表面30 min，结晶紫染色20 min。倒置显微镜下计数，以5个视野的均值表示侵袭细胞数。

1.2.6 划痕愈合实验检测细胞迁移:每组取1×106个细胞接种6孔板，当细胞80%融合时用移液枪头尖端划线，记为划痕0 h，在划痕0 h、48 h时分别测量划痕宽度，计算划痕愈合率。划痕愈合率=(划痕宽度0 h-划痕宽度48 h)/划痕宽度0 h×100%。

1.2.7 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测LINC02474表达:按照Trizol使用说明书提取总RNA，利用PrimeScript逆转录试剂盒将500ng RNA转录成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq II说明进行RT-qPCR反应。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算LINC02474相对表达量。引物序列如下：LINC02474上游5’-CAGCATCTGCCTTT GACCACA-3’，下游5’-CCCATTTCAGGGTAGGGAAAAT-3’；GAPDH上游5’-CTGGGCTAC ACTGAGCACC-3’，下游5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。

1.2.8 蛋白质印记(Western blot)检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达:放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液裂解各组细胞，BCA试剂盒进行蛋白定量。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离适量蛋白样品，并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用5%脱脂奶封闭膜2 h，加入兔源E-cadherin抗体(1∶1 000)、兔源N-cadherin抗体(1∶500)4℃下孵育12 h。用二抗(1∶1 000)室温下孵育膜2 h。加入增强型化学发光显色试剂显影，Image J软件分析E-cadherin、N-cadherin相对表达量。

2 结果

2.1 石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2增殖的影响 与对照组比较，石上柏-低、中、高组Caco-2细胞克隆形成数、S期细胞比例显著降低，G0-G1期细胞比例显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且石上柏-低、中、高组间克隆形成数、S期和G0～G1期细胞比例比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2增殖的影响

2.2 石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2迁移侵袭的影响 与对照组比较，石上柏-低、中、高组Caco-2细胞侵袭数、划痕愈合率、N-cadherin蛋白表达显著降低，E-cadherin蛋白表达显著升高，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。且石上柏-低、中、高组间比较，侵袭细胞数、划痕愈合率、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1。

表2 石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2迁移侵袭的影响

图1 石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2中E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达

2.3 石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2中LINC02474表达的影响 与对照组比较，石上柏-低、中、高组Caco-2细胞LINC02474表达显著降低(P<0.05)，且石上柏-低、中、高组间LINC02474表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2中LINC02474表达的影响

2.4 LINC02474可减弱石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2的增殖抑制作用 与石上柏-高+pcDNA组比较，石上柏-高+pcDNA-LINC02474组Caco-2细胞克隆形成数、S期细胞比例显著升高，G0-G1期细胞比例显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 LINC02474可减弱石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2的增殖抑制作用

2.5 LINC02474可减弱石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2迁移和侵袭的抑制作用 与石上柏-高+pcDNA组比较，石上柏-高+pcDNA-LINC02474组Caco-2细胞侵袭数、划痕愈合率、N-cadherin蛋白表达显著升高，E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表5，图2。

表5 LINC02474可减弱石上柏乙酸乙酯萃取物对Caco-2的迁移、侵袭抑制作用

图2 E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达

3 讨论

石上柏参与调节细胞增殖、凋亡、周期分布、迁移侵袭等多个生物学过程[2]。李三华等[10]发现石上柏乙酸乙酯提取物对肺癌细胞A-549和肝癌细胞SMMC-7721具有显著的抑制作用，当药物浓度为200 μg/ml作用48 h时，对细胞抑制率可高达90%。黄茹意等[3]的研究发现，石上柏乙酸乙酯提取物可抑制喉癌Hep-2细胞的生长和迁移，诱导G1期周期阻滞。此外，石上柏石油醚和乙酸乙酯提取物还可有效降低卵巢癌细胞OVCAR-3的侵袭能力[6]。本研究采用低、中、高剂量浓度探讨石上柏在CRC中的抗肿瘤作用，结果显示，石上柏乙酸乙酯提取物作用后Caco-2细胞的克隆形成能力、S期细胞比例可显著降低，G0-G1期细胞比例显著升高，并呈剂量依赖效应。

肿瘤的侵袭和转移是一个多因素、多阶段的过程，与癌细胞和与之生长的内部环境有关。E-cadherin是维持典型上皮细胞胞间连接结构的Ca2+依赖性粘附分子，E-cadherin表达缺失、间充质细胞标志物N-cadherin表达增加导致细胞骨架重塑和形态发生改变，促进癌细胞的侵袭转移[11,12]。E-cadherin低表达和N-cadherin高表达与CRC局部浸润深度、肿瘤分期、肿瘤分化程度和和较差的生存率密切相关[13,14]。本研究发现，石上柏乙酸乙酯提取物呈剂量依赖效应降低侵袭细胞数和划痕愈合率，降低E-cadherin蛋白表达，提高N-cadherin蛋白表达水平。以上研究结果提示，石上柏乙酸乙酯提取物可降低CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

近年来，多项研究证实lncRNA广泛参与肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的调控[15-17]。Wang等[15]研究证实lncRNA小核仁RNA宿主基因6(SNHG6)通过靶向上游移码突变体(UPF1)激活转化生长因子-β(TGF-β)/Smad信号通路促进CRC细胞的增殖、转移和体内肿瘤生长。Zhang等[16]发现lncRNA CPS1内含子转录本1(CPS1-IT1)显著降低CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并加速细胞凋亡。此外，银杏叶提取物通过上调lincRNA-p21表达还可抑制结直肠癌细胞的迁移[17]。最近发现LINC02474在结肠癌中表达上调，LINC02474表达水平对结肠癌患者预后具有预测价值[9]。

本研究中石上柏乙酸乙酯提取物处理后Caco-2细胞中LINC02474表达呈剂量依赖性降低，提示石上柏乙酸乙酯提取物抗肿瘤作用可能与调控LINC02474表达有关。通过转染pcDNA-LINC02474发现上调LINC02474表达可降低石上柏乙酸乙酯提取物对Caco-2细胞克隆形成、周期分布、迁移和侵袭的影响，恢复细胞的增殖、迁移和侵袭能力，这进一步表明石上柏乙酸乙酯提取物在CRC中抗肿瘤作用可能与下调LINC02474表达有关。

综上所述，石上柏乙酸乙酯提取物可能通过下调LINC02474抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭，这可能是石上柏在CRC中发挥抗肿瘤作用的重要机制，为石上柏开发成CRC临床治疗的药物提供了理论依据。