MR定量技术评估伴纤维化非酒精性脂肪性肝病的研究

赵凡玉，周婷，黄江，张会婷，龙莉玲*

1.广西壮族自治区民族医院放射科，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院放射科，广西 南宁 530021；3.西门子医疗系统有限公司磁共振事业部，湖北 武汉 430071；*通信作者 龙莉玲 cjr.longliling@vip.163.com

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是目前全球最常见的慢性肝病[1]，包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化等不同程度的肝脏损害，早期诊断和及时干预可以阻止甚至逆转疾病进程，若不及时治疗，可导致肝功能衰竭、肝硬化等[2]。目前，MRI是定量评估肝脂肪变性无创、准确的方法[3-4]。多回波Dixon及HISTO序列测得的质子密度脂肪分数（proton density fat fraction，PDFF）较传统Dixon及MRS能够更准确地定量肝脏脂肪含量（liver fat content，LFC），且不受铁沉积影响[5-6]。既往研究显示肝纤维化是非酒精性脂肪性肝炎的进展阶段，会降低MRI测定PDFF的准确性；也有研究认为肝纤维化对PDFF与肝脂肪变性之间的相关性并无显著影响[7-9]。本研究拟通过建立NAFLD伴有不同程度纤维化兔模型，以组织病理学及全肝脂肪生化测定为参考标准，评估MR多回波Dixon及HISTO序列定量肝脏脂肪变性的相关性，并探讨肝纤维化是否对其定量脂肪产生影响，为进一步临床研究应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与模型建立 取27只健康新西兰大白兔，由广西医科大学动物实验室提供，2～3月龄，体重2.0～2.5 kg，雌雄不限。适应性饲养1周后，将实验兔随机分为高脂组22只和对照组5只。高脂组兔用高脂饲料喂养，高脂饲料配方：83%普通饲料+10%猪油+5%蔗糖+2%胆固醇；对照组用普通饲料喂养。所有实验兔分笼饲养，自由饮食及饮用自来水。本研究经广西医科大学附属第一医院伦理委员会批准[2019（KY-E-065）]。

1.2 MRI检查

1.2.1 仪器与方法 采用Siemens Prisma 3.0T超导型MR扫描仪，8通道相控阵兔专用线圈（苏州众志医疗）。适应性喂养2周后，于第3～22周，每周或每隔1周随机选取3只高脂组兔及1只对照组兔行MRI检查。检查前禁食8 h（减少肠道蠕动伪影），于耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1 ml/kg）麻醉实验兔。头先进，肝脏置于线圈中心位置，使用自制绷带束缚麻醉兔上腹部，以减少呼吸运动伪影。

1.2.2 扫描序列和参数 扫描序列包括横断面T1-StarVIBE、6回波Dixon和HISTO序列。6回波Dixon序列扫描参数：TE分别为1.26、2.60、3.94、5.28、6.62、7.96 ms，TR 9.25 ms，层厚3.5 mm，矩阵160×120，带宽1 200 Hz/Pixel，视野120 mm×100 mm，扫描时间16 s。HISTO扫描参数：TE分别为12、24、36、48、72 ms，TR 3 000ms，带宽1 200 Hz，体素3～5 cm3，扫描时间15 s。光谱体素定位在3个平面上，避开主要血管和肝脏边缘，边缘长度为1.4～1.7 cm。

1.2.3 图像分析 使用图像工作站及相应后处理软件进行图像分析。由2名主治医师采用盲法独立分析图像。在多回波Dixon序列生成的脂肪分数图及R2*弛豫率图（R2* map）上选取相同位置各画5个感兴趣区（ROI），测量得出肝脏ME Dixon-PDFF、ME Dixon-R2*值，计算平均值。ROI的选取应找肝脏最大层面及上、下两层，同时避开血管、胆管及肝脏边缘地区，且面积、大小一致。HISTO在线自动生成所选取体素内的脂肪信号与总信号（水+脂肪）的比值即肝脏脂质密度脂肪分数（HISTO-PDFF），以及对数线性指数拟合得到的R2water值的报告。

1.3 病理学及生化检测 MRI扫描结束后，选取高脂组兔1只处死，对照组兔分别于第4、8、12、16、20周检查后处死。静脉注射戊巴比妥（100 mg/kg）处死实验兔，解剖并完整取出肝脏组织，观察肝脏形状、颜色、质地，去除胆囊，应用排水法测量肝脏体积。然后取0.5～1.0 cm3肝组织，置于10%福尔马林溶液中固定12 h，蜡埋、切片，分别行HE染色、Masson染色及普鲁士蓝染色。光镜下由2位病理医师采用盲法阅片，分别对脂肪肝分级、纤维化分级及铁沉积进行分析和判定，意见不一致时讨论达成共识。依据非酒精性脂肪肝炎临床研究网络标准[10]，将脂肪肝分为0、1、2、3级，肝纤维化分为F0、F1、F2、F3、F4期。将取完病理剩余的肝脏去除大的血管和胆管，用双蒸水反复冲洗后装入塑料袋密封，及时送广西分析测试研究中心按中华人民共和国国家标准GB/T5009.6-2016第二法（酸水解法）检测肝脏湿重脂肪含量[11]。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件，连续变量以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。采用组内相关系数（ICC）评估2名MRI医师测量结果的一致性。采用Pearson或Spearman相关分析计算MRI各指标与病理生化结果的相关性。用Bland-Altman法分析多回波Dixon及HISTO序列测得PDFF的一致性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 造模过程中，高脂组5只实验兔因高脂饮食死亡，最终本实验对22只兔（对照组5只，高脂组17只）进行病理及化学检测分析，并采用实验兔处死前最后一次MRI扫描结果进行测量。实验过程中高脂组兔2个月后易出现食欲缺乏、消瘦、脱毛、皮肤粗糙暗沉等症状，此时解剖实验兔发现肝脏明显增大、变硬，边缘圆钝，呈灰白色，无光泽，部分伴有腹水。对照组兔肝柔软，呈鲜红色，有光泽。高脂组与对照组兔平均体重差异无统计学意义（P=0.092）；高脂组兔肝脏体积明显大于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 对照组与高脂组兔一般资料及MRI检测结果比较（±s）

表1 对照组与高脂组兔一般资料及MRI检测结果比较（±s）

注：LFC：肝脏脂肪含量；ME Dixon：多回波Dixon；PDFF：质子密度脂肪分数

项目高脂组（n=17）对照组（n=5）t值P值体重（kg） 2.69±0.39 3.02±0.25 －1.77 0.092＜0.001 LFC（100 mg/g） 11.41±4.03 3.11±0.32 8.39 ＜0.001肝脏体积（ml）135.00±37.33 72.20±8.90 6.35＜0.001 HISTO-PDFF（%） 7.35±3.27 1.30±0.55 7.29 ＜0.001 ME Dixon-PDFF（%）7.69±2.71 2.07±0.53 4.53 ME Dixon-R2*（1/s）54.23±15.18 61.94±12.09－1.17 0.272

2.2 病理及生化测定脂肪含量结果 实验兔肝HE染色、Masson染色结果见图1～3，其中高脂组兔经酸水解法测定LFC为（9.52±5.00）%（4.30%～16.70%）。高脂组兔肝组织活检脂肪肝分级：1级2只、2级10只、3级5只。组织活检脂肪肝分级与LFC呈显著正相关（r=0.837，P＜0.05）。纤维化分级：F0期3只、F1期5只、F2期4只、F3期3只、F4期2只。随着饲养时间延长，HE染色见细胞脂肪变、炎症细胞逐渐增多；Masson染色可见纤维成分逐渐增多，小叶结构破坏，最终出现假小叶。对照组兔肝细胞排列紧密、规则，未见脂肪样变、炎症细胞浸润及纤维化，LFC为（3.11±0.32）%（2.70%～3.52%）。高脂组与对照组普鲁士蓝染色未见铁颗粒沉积或仅有极少量蓝色铁颗粒沉积。

2.3 MRI检查结果

2.3.1 MRI 测值结果分析 2 名观察者测量ME Dixon-PDFF值的一致性良好（ICC=0.965，95%CI0.902～0.987）。最终取2位医师测量结果的平均值做进一步分析。

高脂组兔肝MR测得ME Dixon-PDFF、HISTO-

2.3.2 MRI参数与病理及生化测量值的相关性 所有实验组兔肝脏脂肪肝分级、ME Dixon-PDFF、HISTO-PDFF均与LFC呈高度正相关（r=0.837、0.818、0.723，P均＜0.05），见图6、7。在无或早期纤维化阶段（F0、F1），ME Dixon-PDFF、HISTO-PDFF与LFC呈高度正相关（r=0.977、0.966，P均＜0.01）；在进展期及晚期肝纤维化阶段（F2～F4），ME Dixon-PDFF、HISTO-PDFF与LFC均无相关性（P＞0.05）。

3 讨论

随着MRI技术的发展，多回波Dixon、MRS技术成为目前无创、快速、有效地定量评估肝脏脂肪变的方法。多回波Dixon属于三维梯度回波序列，通过采集更多回波，使用更先进的采集方式和更优化后处理算法，可以有效减少误差。此时得到的组织中脂肪质子密度与总质子密度的比值，可以更准确地定量组织的脂肪PDFF值均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。高脂组兔肝与对照组测得ME Dixon-R2*值差异无统计学意义（P=0.272），见表1。所有实验兔测得ME Dixon-PDFF与HISTO-PDFF值呈显著正相关（r=0.916，P＜0.001），且具有较好的一致性（ICC=0.952，95%CI0.883～0.980），见图4、5。含量。HISTO是一种单体素高速T2校正多回波1HMRS序列，具有刺激回波采集模式（STEAM），可以通过校正水和脂肪的R2弛豫量化脂质百分比。多回波Dixon及HISTO在伴有铁沉积情况下仍能够客观、准确地定量肝脂肪含量，具有较高的敏感度和特异度，不受铁沉积影响[12-14]。然而，目前关于纤维化对磁共振PDFF测定肝脂肪变性的准确性有无影响研究较少，并且存在一定的争议，有研究认为肝纤维化降低了病理穿刺与PDFF的相关性[7]，也有研究认为肝纤维化对PDFF与肝脂肪变性之间的关系并无显著影响[8]。

图4 实验兔肝脏ME Dixon-PDFF与HISTO-PDFF的相关性

图5 实验兔肝脏ME Dixon-PDFF与HISTO-PDFF的Bland-Altman分析

本研究发现，在实验早期阶段，高脂组兔肝脏无纤维化或处于早期纤维化阶段时，MRI获得的PDFF与酸水解法测得的LFC呈高度正相关；而在后期，随着肝纤维化程度加重（F2～F4），PDFF与LFC的相关性下降。影响MRI评估肝脏脂肪变性准确性的主要因素是肝纤维化和铁含量[15]，而本研究中所有实验组兔无肝铁沉积或仅有极少量铁沉积，因此推测肝纤维化降低了PDFF与LFC的相关性。曹迪等[16]应用MR

Idilman等[7]纳入70例NAFLD研究发现，肝脏纤维化时肝组织活检结果与MRI-PDFF的相关性为0.60，而没有纤维化时的相关性为0.86。Tang等[8]报道肝纤维化不影响MRI脂肪定量与肝脂肪变性的关系。本研究推测，研究对象中患有晚期纤维化所占比例越高，报告纤维化效应影响的可能性越大；报告未受纤维化阶段影响的研究多数仅0～15%的晚期纤维化受试者[8,17]，而确实显示受纤维化阶段影响的研究多数含有15%以上的晚期纤维化受试者[7,18]。目前纤维化影响MRI定量LFC的具体原因尚未阐明，可能与纤维化会导致组织局部磁场磁化率不均或脂质密度下降造成组织信噪比过低有关。因此，采用MRI进行脂肪定量时，需考虑肝纤维化对结果的影响。

MRI是一种可以量化LFC的非侵入性技术，尤其在早期肝纤维化阶段，其定量肝脂肪变性的准确性优于肝组织活检。本研究中，在早期肝纤维化阶段（F0、F1期），MR测得的ME Dixon-PDFF、HISTO-PDFF值与LFC均呈高度正相关。Noureddin等[19]报道与肝组织活检相比，PDFF对脂肪变性的定量诊断有更好的准确度。首先，MRI显示脂质和水的质子比例，是一种定量分析；而病理分析显示单位视野内脂肪变性的肝细胞比例，是一种半定量分析。其次，MR-PDFF值可以计算全肝脂肪分量，而肝穿刺取材体积有限，且不可重复。肝脏脂肪分布往往具有不均匀性，因此，MRI对早期肝纤维化阶段肝脂肪变性定量更准确，可以更好地了解和监测疾病的治疗效果。

图7 HISTO-PDFF与LFC的相关性。PDFF：质子密度脂肪分数；LFC：肝脏脂肪含量

本研究结果显示，多回波Dixon及HISTO测得的IDEAL-IQ序列定量NAFLD兔模型研究发现，中重度脂肪肝的PDFF与病理结果出现离散度变大的情况，与本实验结果一致。PDFF呈高度正相关，两者无显著差异，且具有较高的一致性。但HISTO序列为单体素波谱序列，其空间选取范围有限，无法避免采样误差；且多回波Dixon具有较高的图像分辨率，并且可以同时量化全肝覆盖范围内的脂肪和铁沉积，能够更有效地定量肝铁含量，其诊断性能优于HISTO序列，因此三维多回波Dixon技术具有更广阔的应用前景。

目前建立NAFLD动物模型的相关研究大多采用高脂高糖喂养方法，此模型操作方便，动物死亡率低。本研究发现，高脂组兔喂养2周后即可达到轻度脂肪肝，随着造模时间延长，肝脂肪变性程度加重。连续喂养2个月后高脂组兔易伴发消瘦、毛发脱落、四肢溃烂、感染等并发症，此时MR扫描实验兔肝PDFF值上升趋于平缓或下降。本研究中模型最长制备时间为22周，解剖发现实验兔肝脏明显硬化，边缘粗糙，并伴有腹水，提示出现肝纤维化甚至肝硬化。处死后病理切片见肝组织明显脂肪变（3级）及纤维化（F4期），证实了这一猜想。但由于实验兔具有个体差异，其肝脏脂肪变性及纤维化的进展程度不一致。

本研究的局限性：未在MRI上对肝纤维化进行定量分析，将在后续实验中进一步研究。实验兔与人体在脂肪代谢方面存在较大差异，因此不能完全复制人类NAFLD的发病机制。本实验纳入样本量较小，其结果可能具有一定的偏差，有待进一步开展大样本、多中心研究深入探讨。总之，使用MRI的PDFF可以定量测量LFC，PDFF与生化检测LFC有很强的相关性。然而，纤维化的存在会使其相关性降低。