Box-Behnken响应面法优化苗药课币有水溶性黄酮提取工艺
2022-03-16赵学芬何席呈吴珊珊
赵学芬，何席呈，杜 江，谭 波，吴珊珊
(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)
0 引言
【研究意义】苗药课币有(kod bit vud)为天南星科植物一把伞天南星Arisaemaerubescens(Wall.)Schott.的块茎，走中、里两关，入脑、身两架，其味苦、辣；性热，属冷经，有大毒，具有败毒、清风毒、止痉、止咳化痰、消肿散结的功能，在苗药分类里属于攻毒药，常用于治疗痈疽肿毒、疮疡溃烂、半身不遂，各种癌症，跌打损伤、毒蛇咬伤等病症[1-2]。但其产生作用的物质基础不明确，导致质量控制体系简单，限制其临床应用和产品开发。开展课币有有效成分提取工艺研究，可对其物质基础的研究奠定基础。【前人研究进展】课币有具有良好的镇静、镇痛、抗惊厥、祛痰等作用，且具有抗肿瘤、抗菌、杀线虫活性等生物活性[3-10]。化学成分研究表明其含有黄酮[11]、生物碱[12]、苯丙素[13]、甾体[14]、萜类[15]、苷类[16]、酯类[17]等化合物。【研究切入点】黄酮类成分为课币有主要成分[18-19]，2020年版《中国药典》以总黄酮作为课币有质量控制指标，且具有抗肿瘤活性[20]。目前针对课币有黄酮类成分提取工艺研究不多。【拟解决的关键问题】采用Box-Behnken响应面法对黄酮类成分提取工艺进行研究，探明课币有黄酮类成分组成，以期为课币有质量控制及药理作用研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
苗药课币有购自贵阳太升药材市场。试验试剂芹菜素(对照)购自贵州迪大生物科技有限责任公司。无水乙醇、三乙胺等为分析纯，水为蒸馏水。仪器设备包括UV-1800 UV-VIS分光光度计，日本岛津公司生产；MS105UD分析天平，瑞士MEFTTLER TOLEDO仪器有限公司生产；L530R离心机，湘仪离心机仪器有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 对照品溶液的制备 称取芹菜素对照品适量，以0.1%三乙胺的60%乙醇溶液配置成每1 mL含12.06 μg芹菜素溶液，即得。
1.2.2 标准曲线的绘制 精密量取芹菜素对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL于10mL量瓶中，用60%乙醇溶液稀释至5 mL，加1%三乙胺溶液至刻度，摇匀。以相应的60%乙醇溶液、1%三乙胺溶液为空白，按照紫外-可见分光光度法(2020年版《中国药典》四部通则0401)，在400 nm波长处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标(y)，以对照品溶液浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线。
1.2.3 不同因素对课币有总黄酮得率的影响 精确称取课币有粉末(过四号筛)2 g置于100 mL具塞锥形瓶中，按照浸泡提取→过滤→测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中黄酮(以芹菜素计)的提取量，计算提取率。分别考察提取溶剂、提取温度、提取时间、固液比等单因素对提取量的影响。
1) 提取溶剂。精确称取6份各2 g课币有粉末，置于100 mL具塞锥形瓶中，分别加入15 mL蒸馏水、10%乙醇(V/V)、20%乙醇(V/V)、30%乙醇(V/V)、40%乙醇(V/V)和50%乙醇(V/V)，于室温下(15℃)浸提30 min，过滤，3次重复，合并滤液，考察不同溶剂条件下课币有的黄酮提取量。
2) 提取温度。精确取5份各2 g课币有粉末，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入34 mL蒸馏水，分别于10℃、30℃、50℃、70℃、90℃下浸提30 min，过滤，3次重复，考察不同提取温度条件下课币有的黄酮提取量。
3) 提取时间。精确称取5份各2 g课币有粉末，置于100 mL具塞锥形瓶中，分别加入40 mL蒸馏水，50℃下分别浸提10 min、30 min、50 min、70 min、90 min，过滤，3次重复，考察不同提取时间条件下课币有的黄酮提取量。
4) 固液比。精确称取5份各2 g课币有粉末，置于100 mL具塞锥形瓶中，以蒸馏水为溶剂，分别按固液比(g∶mL)为1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24进行配置，于50℃下浸提55 min，过滤，3次重复，考察不同固液比条件下课币有的黄酮提取量。
1.2.4 Box-Behnken试验优化提取工艺 根据单因素试验结果结合Box-Behnken设计原理，选取提取时间(A)、提取温度(B)、固液比(C)3个因素作为课币有黄酮类成分提取工艺考察因素，运用Design-Exppert V8.0.6 Box-Behnken进行星点设计，试验因素和水平见表1。计算黄酮提取量及提取率。
表1 因素水平表
1.2.5 验证试验 精确称取3份各2 g课币有粉末，置于100 mL具塞锥形瓶中，按照Box-Behnken试验得出的最优工艺操作，对其进行验证。
1.3 统计分析
采用Design-Exppert V8.0.6和Spss进行试验数据处理分析，并作图。
2 结果与分析
2.1 课币有黄酮的标准曲线
根据在400 nm波长处测定的吸光度，以对照品浓度为横坐标(x)，吸光度(y)为纵坐标得到作回归曲线(图1)。其拟合线性回归方程为y=0.059 7x+ 0.004 7(R2= 0.999 5)，线性范围为2.246 0～11.320 μg/mL，说明黄酮浓度与吸光度存在良好的线性关系。
图1 课币有黄酮的标准曲线
2.2 不同提取条件课币有的黄酮提取量
从图2可知，提取溶剂、提取时间、提取温度、固液比不同处理条件下课币有的总黄酮提取量存在差异。
图2 不同提取因素及水平课币有的黄酮提取量
2.2.1 提取溶剂 随着提取溶剂中乙醇浓度增加，课币有中黄酮的提取量呈下降趋势，黄酮提取量为0.903 2～1.154 7 mg/g。选用蒸馏水为提取溶剂时，其黄酮提取量最高，表明课币有黄酮主要为水溶性黄酮，故选择蒸馏水作为响应面试验条件最佳提取溶剂。
2.2.2 提取温度 不同提取温度下课币有的黄酮提取量为0.740 3～1.293 9 mg/g，在
提取温度10～70℃范围课币有黄酮提取量随提取温度上升而增加，至70℃时最高，以后则下降。但70℃较50℃而言，提取量增幅小于5%。
2.2.3 提取时间 课币有黄酮提取量随提
取时间增加呈先增后减趋势，在提取时间10～90 min条件下黄酮提取量为1.095 3～1.353 0 mg/g，提取时长为70 min时黄酮提取量最高，之后趋于平缓且开始降低。
2.2.4 固液比 随着溶剂体积增加，黄酮提取量缓慢增大，在固液比(g∶mL)为1∶16～1∶48条件下黄酮提取量为1.083 7～1.342 8 mg/g，其中，固液比为1∶24时黄酮提取量基本趋于平缓，之后略有小幅增加。
2.3 响应面试验对提取工艺的优化
2.3.1 不同提取因素组合课币有黄酮的提取量 从表2可知，在17个不同提取因素组合处理条件下课币有的黄酮提取量为0.48～1.31 mg/g。其中处理1即固液比1∶17、提取温度50℃、提取时间55 min时课币有黄酮提取量最高，为1.31 mg/g。处理13即固液比1∶10、提取温度80℃、提取时间55 min时课币有黄酮提取量最低，为0.48 mg/g。
表2 Box-Behnken试验的提取因素组合及其黄酮提取量
2.3.2 黄酮提取量与提取因素的模型构建 对黄酮提取量进行二次多元回归拟合得到黄酮提取量(Y)对提取时间(A)、提取温度(B)和固液比(C)3个影响因素的多元线性回归二项式方程为：Y=0.088 35-8.027×10-3A+0.022 745B+0.057 90C-2.381×10-6AB+5.991×10-4AC+3.809×10-4BC+8.927×10-5A2-3.817×10-4B2-2.214×10-3C2-5.539×10-6A2C。从表3看出，模型F=126.33，P<0.000 1；失拟性P=0.271 4(>0.05)，表明模型无失拟因素存在。R-Squared与Adj R-Squared 接近且趋近于1，分别为0.995 3和0.987 4，模型可靠。
表3 课币有黄酮提取工艺回归分析结果
2.3.3 课币有黄酮最佳提取工艺 以课币有黄酮提取量最大值为标准，根据课币有黄酮提取量与任意2个因素的三维效应面曲线和等高线(图3)直观分析，得到课币有黄酮最佳提取工艺参数为：提取时间90 min，提取温度46.37℃，固液比为1∶20(溶剂量41.32 mL)，在该条件下，课币有黄酮预测提取量为1.34 mg/g。
图3 提取时间、提取温度、固液比对黄酮提取量的响应面和等高线
2.3.4 最佳提取工艺验证 结合实际操作，将验证条件修正为固液比1∶20(溶剂量40 mL)、45℃条件下提取90 min，对优化后的提取工艺进行验证。验证结果表明，3次试验的黄酮提取量分别为1.32 mg/g、1.34 mg/g和1.32 mg/g，平均为1.33 mg/g，与预测值(1.34 mg/g)接近，偏差为0.75%，说明该工艺可靠。
3 讨论
苗药课币有黄酮类成分对Walker256骨癌痛模型大鼠具有镇痛作用，可抑制α-黑素细胞刺激素刺激的B16F1细胞黑色素生成增加，还可抑制体外培养肺癌A549细胞的增殖[7,20]。苗药课币有黄酮类成分主要包含以芹菜素为母核的黄酮苷类、异夏佛托苷、夏佛托苷等，但其成分组成、药理作用机制并不明确，而提取工艺会影响黄酮类成分组成和提取量，导致质量不稳定。
响应面分析法(response surface method，RSM)又称为回归设计，是由数学、统计学和计算机紧密结合并且能够精准的表达响应值与各因素之间关系的优化分析方法。由于RSM创建的是复杂的多维空间曲面，较接近实际情况，与正交试验法相比较，RSM的模型连续，设计简单，精准度更高，并且试验次数少，能适用于多因素、多水平的研究，因此响应曲面回归模型近年来被广泛用于中药的提取、制备等工艺优化研究。试验采用星点响应面法对课币有黄酮类成分提取工艺进行研究，可为课币有质量控制和药理作用研究提供基础。
4 结论
通过单因素试验确定影响苗药课币有黄酮提取效果的提取温度、提取时间、固液比3个因素的水平参数，采用响应面法优化黄酮提取工艺，最终得到苗药课币有黄酮热浸法最佳提取工艺：以蒸馏水为提取溶剂，提取温度为45℃，固液比(g∶mL)1∶20，提取时间90 min，所得水溶性黄酮类化合物的提取量最高，达1.33 mg/g，验证结果与模型预测值(1.34 mg/g)接近。在最优工艺基础上对提取次数进行考察表明，第2次可基本完成课币有黄酮的提取，故苗药课币有黄酮最适提取次数为2次。
