动物疫病荧光PCR检测中假阳性的原因分析与控制

张梅，高军军，康文彪

（甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730046）

实时荧光定量PCR技术特异性强，可以从低微含量样本中扩增病原特异性核酸片段，实现对病原的精准检测[1-2]，已被广泛应用于动物病原学检测，是目前兽医实验室病原学检测工作中必不可少的检测手段。假阳性是指原本的阴性样品被检测为阳性结果[3]。随着动物病原学检测量的不断增多，加之荧光PCR敏感度高，试验人员为快速完成检测任务易忽视检测中关键步骤的细节问题，以致出现假阳性结果，对疫情准确诊断造成了困扰。本文通过分析动物疫病荧光PCR检测中可能形成假阳性的原因，并提出控制措施，以期为兽医实验室PCR检测工作提供参考。

1 动物疫病荧光PCR检测中假阳性的原因分析

造成假阳性的原因主要是样品、试剂、环境、仪器等被污染。

1.1 样品间交叉污染

放置样本时由于离心管质量问题或密封不严，容器外粘有样品导致样品间相互污染；核酸污染物通过气流或实验人员流动污染实验室局部环境、离心机、枪头等导致检测样品间相互污染；加核酸模板时未及时更换枪头导致相邻样品相互污染等。

1.2 PCR扩增产物污染

PCR扩增产物污染是动物疫病荧光PCR试验中常见的污染问题，因荧光PCR扩增产物拷贝基数大，呈指数倍增长[3]，极微量的污染就会造成分析结果中单一通道的翘尾现象，PCR扩增产物处理不当会出现大量的假阳性结果。

1.3 实时荧光定量PCR试剂污染

在荧光PCR反应体系配制过程中，由于实验室局部环境、移液器、耗材、反应体系已被气溶胶或阳性对照污染，或在DNA或RNA提取过程中使用已经被污染的提取试剂，会出现样品孔大面积阳性的结果，这也是导致假阳性的原因之一[4]。此外，有的厂家生产的不同批次的荧光PCR反应体系试剂检测结果的可重复性低，也会造成假阳性结果。

1.4 气溶胶污染

PCR实验室一半以上的污染来自气溶胶，气溶胶在流通的空气中扩散，导致室内环境、仪器被污染，造成假阳性结果。加样过程中移液器加样力度太大，或加完样往废液缸中打废弃枪头的速度太快产生反冲，导致气泡和样品液进入移液器头部套筒，对活塞密封圈造成损伤，同时带入的气雾造成气溶胶污染[5]；样品开盖前未离心或颠倒混匀时用力过猛形成气溶胶，导致操作环境被污染。

1.5 阳性质控品污染

目前兽医分子生物学实验室使用成熟的商品化荧光PCR试剂盒，商品化试剂盒阳性质控品多为克隆质粒，如非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒、禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，质粒生长繁殖快、生命力顽强，极易造成污染[5]，在操作不规范的情况下质粒外溢致使假阳性概率增大。

1.6 试验操作者的污染

检测过程中检测任务量大，由于过于追求检测效率而没有注意操作细节，不规范操作容易造成气溶胶或扩增产物污染。同时，试验操作者的实验服、工作鞋及未经消毒的物料外包装等携带的核酸片段也会造成PCR污染[6]。

2 动物疫病荧光PCR检测中假阳性控制措施

2.1 规范采集和运输样品

严格遵守样品采集操作规范，确保采集样品的容器（离心管、采血管、OP液管等）密封严密、运输过程中不发生交叉污染。所采集的样品容器管口用封口膜密封处理，送入二级生物安全柜内无菌取样处理，每份样品分装成两份，一份检测，一份留样（目的是确保样品可溯源、试验结果有误差时用于复核）。留样样品检测完密封包装，表面用有效消毒剂喷洒消毒后，保存于-20 ℃专用冰柜。运输样品需要三层包装和专业包装箱，以防止发生生物安全事故，最外层包装设置向上箭头标志；路途较远时需全程冷链运输或航空运输。

2.2 加强仪器设备操作管理

使用仪器时严格按照操作规范进行，定期对精密仪器等进行校准和维护。如定期维护移液器精确度、离心机转速、实时荧光定量PCR仪的温控模板和性能稳定性；定期更换生物安全柜的过滤器和空调过滤网。严禁仪器在各功能区混用，尤其是配液区的移液器不能与其他区混用。推荐使用全自动核酸提取仪[7]，实现自动化和封闭式操作，避免人员反复开盖加入或倒出试剂的过程中导致气溶胶污染，减少核酸抽提过程中的假阳性发生率。试验完成后做好荧光PCR仪、金属浴、生物安全柜、混匀振荡器等仪器使用情况及运行状况的记录。仪器校准维修后做好校准、维护保养及验收记录，确保相关记录可追溯。

2.3 健全试剂、耗材管理制度

采购国家批准厂家生产的特异性高、稳定性好的荧光PCR试剂盒[8]，禁止使用过期或质量不合格的试剂。每一批次的试剂均须加阳性质控品或进行盲样验证，合格后可正常进行PCR试验。所有荧光PCR反应体系的分装应在配液区进行，试剂盒中的阳性对照及阳性质控品应保存在样品制备区的冰箱[9]。及时清理配液区、样品制备区和扩增分析区所有长时间暴露的试剂、耗材，做好试剂、耗材出入库和使用记录，及时对采购的试剂、耗材进行质量验证，不断完善试剂、耗材管理制度。

2.4 加强对试验人员的技术培训和管理

新员工开展检测前对其进行PCR试验检测操作规程、试验原理、质量体系、生物安全管理等方面的培训，并通过理论考试、内部人员比对试验、盲样比对等方式进行考核。所有试验人员需经检测能力验证、仪器规范操作等培训后持岗上证，并每年对试验人员进行盲样考核[10]。实验室质量负责人要加强对检测人员的监督，实行责任制。检测人员要严格按照检验操作规程进行试验，从配液区到扩增产物分析区须单向流动，注意容易发生污染的每一个细节。每次的PCR检测需设立阴性对照、空白对照和阳性对照；已加入核酸模板的PCR反应管禁止再次打开管盖，避免样本间的交叉污染；扩增产物分析区的物品及工作服禁止带出，避免扩增产物污染；样品使用前需先离心，再轻柔开盖，防止液体溅出造成污染；提取核酸的关键步骤要及时更换一次性手套；样品核酸模板的加样顺序依次为阴性对照、检测样品、阳性对照；设计好试验对照，便于分析假阳性结果[11]。

2.5 加强实验室环境管理

2.5.1 合理设计各工作区域 PCR实验室至少有3个工作区，各工作区按照单方向进行PCR检测，即配液区→样品制备区→扩增产物分析区，不得逆行[6]。各工作区域内的仪器、物品不得交叉使用[12]，各区域的仪器设备（移液器、生物安全柜、高速离心机等）和物品（96孔板、工作服、抹布、生物安全垃圾桶等）用防水标签标记清楚，以便于鉴别。废弃物临时贮存室应远离PCR实验室。

2.5.2 规范开展日常消毒 每次试验前打开空调系统，对工作台面、地面进行清洁，并用2.3%有效氯消毒剂擦拭消毒；对生物安全柜的内表面和移液器的头部用75%酒精和2.3%有效氯消毒剂擦拭消毒。但含氯消毒剂具有腐蚀性，消毒完成后需用纯水再次擦拭。试验结束后对废液缸里的废弃物进行高压灭菌处理，并将废液缸用84消毒液浸泡消毒；移出生物安全柜内的所有耗材和剩余试剂样品，将生物安全柜台面、移液器头部、离心机等先用75%酒精擦拭2遍，再用核酸清除剂擦拭消毒2遍，工作台面和地面用2.3%有效氯消毒剂（现配现用）擦拭至少5 min（各工作区消毒器具不可混用）；PCR扩增产物用5%有效氯消毒剂浸泡12 h以上；96孔板、试管架等可重复使用的物品用5%有效氯消毒剂浸泡消毒12 h；消毒完成后打开安全柜，用移动紫外灯照射1 h。此外，要定期对PCR实验室进行彻底清扫消毒，并对生物安全柜用3%过氧化氢熏蒸消毒4 h以上。

2.5.3 加强通风 气溶胶是PCR实验室产生污染的原因之一，每隔一定时间须更换空调过滤网，并定期打开空调系统进行通风换气，降低气溶胶造成污染的风险。

3 结语

动物疫病荧光PCR检测中出现大量阳性结果时，应怀疑是否为PCR实验室污染，并通过人员比对、试剂比对、盲样比对查找原因，若为PCR实验室污染时须采取科学的控制措施，并重新采样，更换实验室进行检测，确保检测结果的准确性。假阳性会造成疫情误判，诊断某种动物疾病时，须结合临床症状和国家制定的确诊标准[13]。此外，要加强对PCR实验室的日常管理，规范检验人员的操作，做好PCR实验室内部质控，及时规范处置危险废弃物（废弃试剂、耗材、样品、PCR扩增产物、防护用品等），确保荧光PCR检测结果准确可靠。