β-catenin基因对合作猪绒毛生长发育的影响

孔梦洁，耿永琪，杨 磊，秦永斌，黄晓宇,2*，滚双宝,2

（1.甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省现代养猪工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070）

合作猪又被称为蕨麻猪、山猪，具有适应高海拔恶劣环境、抗寒、抗病、耐粗饲等特点，个体较小，体躯较短，四肢结实紧凑，周身被毛黑色，少数出现棕色。寒冷季节，合作猪身上会长出棕色绒毛，温暖炎热季节身上绒毛退化，直至消失，这种现象可能与合作猪周期性生长绒毛以抵御寒冷环境，从而适应高海拔高寒地区的环境有关。因此，探究合作猪绒毛生长相关基因对于研究合作猪的抗寒性能具有重要意义。

β-catenin基因是机体内一种重要的功能蛋白，可与很多蛋白相互结合形成复合体[1-2]。其遍布动物体各个结构中，功能十分丰富，且在动物进化过程中非常保守。截至目前，主要在动物间质组织和上皮组织中发现了β-catenin基因的存在。研究证实，β-catenin基因在毛发生长中具有调节作用。当β-catenin基因发生突变或被敲除后，存在于动物体皮肤中的毛囊则不会继续发育，而补偿缺失的β-catenin基因后，毛囊又会长出新的毛发，这充分说明β-catenin基因在毛囊生长发育过程中是必须存在的[3-4]。还有研究表明，在毛囊的发生发育过程中β-catenin基因会被激活，以此促进细胞的增殖分化，从而促进毛囊结构的发生发育[5]。此外，Plikus等[6]以小鼠皮肤组织作为模型探究毛囊膨出处的毛干细胞调控机制时，发现β-catenin基因在炎热与寒冷环境下分别表现为高活性和低活性，说明其在毛干细胞调控过程中与温度变化呈正相关。目前关于β-catenin基因的研究主要是围绕人体β-catenin基因开展，而关于猪β-catenin基因及其在绒毛生长发育过程中的研究鲜有报道。

本试验以夏季和冬季的合作猪皮肤组织为研究材料，通过qRT-PCR探究β-catenin基因在合作猪绒毛生长过程中的表达特征及作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物 本研究以甘南州迭部县8月龄合作猪为研究对象，在夏季极热和冬季极冷的时间点采集5 cm×1 cm的猪皮肤。具体采集颈部、肩部、侧部、臀部等组织样品作为本次试验样品。

1.1.2 主要试剂、耗材 Trizol新型RNA抽提剂、2*Taq PCR MasterMix、反转录试剂盒、dNTP Mixture、Oligo dT Primer、RNase Inhibitor、DNA凝胶回收试剂盒等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 在夏季极热和冬季极冷时间点分别选择健康的8 月龄合作猪各20 头。将两组试验对象宰杀后，在无菌条件下采集其颈部、肩部、侧部、臀部等部位大小为5 cm×1 cm的皮肤组织样品备用，将样品在液氮中快速冷冻，放到-80 ℃冰箱存放。

1.2.2 引物设计与合成 以GenBank中的猪β-catenin基因核苷酸序列为参考，运用NCBI中的Primer Premier 5.0和Primer-BLAST工具，按照定量引物设计的一般原则，设计本次实时荧光定量PCR分析试验所需的特异性引物，并由陕西中科羽瞳生物科技有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 引物信息

1.2.3 RNA提取与cDNA模板合成 采用Trizol试剂抽提合作猪仔猪的臀部、侧部、肩部和颈部等部位组织的RNA，分别运用凝胶电泳法、分光光度计法检测所抽提的RNA（验证完整性和纯度），将得到的cDNA放到-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 实时荧光定量PCR 分别以不同部位组织的cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因，采用qRT-PCR检测β-catenin基因在合作猪臀部、侧部、颈部和肩部等组织的表达量。qRTPCR反应体系、反应条件分别见表2、表3。为减少试验误差，每组设3个重复，用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表2 qRT-PCR反应体系

表3 qRT-PCR反应条件

2 结果与分析

2.1 β-catenin基因扩增曲线

从β-catenin基因的扩增曲线可以看出（图1），虽然曲线在平台期有所变化，但在指数增长区域的重复性非常好，说明适宜进行聚合酶链式反应（PCR）的定量分析。

图1 β-catenin基因的扩增曲线

2.2 β-catenin基因溶解曲线

如图2所示，β-catenin基因的溶解曲线峰形为单一窄峰，无杂峰出现，说明该试验所设计的引物特异性良好，可以进行后续试验分析。

图2 β-catenin基因的溶解曲线

2.3 β-catenin基因在不同组织中的表达

通过qRT-PCR检测合作猪各组织中β-catenin基因的表达水平（表4、图3），发现合作猪4个部位中β-catenin基因的表达量夏季均高于冬季，说明β-catenin基因的表达量与温度变化呈正比。此外，冬季合作猪β-catenin基因在肩部（0.85±0.13）和臀部（0.79±0.14）的表达量相比侧部（0.62±0.11）和颈部（0.50±0.077）要高，而夏季肩部（0.85±0.14）和臀部（0.89±0.0071）较侧部（1.00±0.08）和颈部（0.92±0.091）的表达量低，说明合作猪肩部和臀部的β-catenin基因随着温度变化表达量较为恒定，而侧部和颈部的β-catenin基因表达量随温度变化起伏较大。以上结果表明，合作猪β-catenin基因与温度变化呈正相关，但随着温度的变化，肩部和臀部的β-catenin基因表达较为恒定，这或许是冬季合作猪肩部和臀部绒毛生长的原因之一，但具体分子调控机制还有待研究。

表4 荧光定量分析结果

图3 β-catenin基因在合作猪夏、冬季节不同组织中的表达水平

3 讨论

毛囊的生长发育依靠多种信号分子的共同作用，其中大部分的信号分子属于Wnt信号通路以及一些其他传导通路和因子等。上皮细胞和真皮细胞受到这些信号分子的共同作用，促进细胞的增殖与分化，并最终形成毛囊结构。Wnt/β-catenin信号通路与分子激活在毛囊的生长和发育中起着重要的调节作用[7]。β-catenin是经典Wnt/β-catenin信号通路中的主要调控蛋白中的一种，具有促进细胞增殖的作用[8]。β-catenin基因是毛发生成过程中的重要存在，其突变会导致毛囊基板的产生被阻断，敲除毛囊中β-catenin基因会导致毛发掉落[9]。目前关于β-catenin基因的研究主要是围绕人体β-catenin基因开展，而关于猪β-catenin基因及其在绒毛生长发育过程中的相关研究较少。

动物绒毛的生长是季节性变化的，大部分动物皮肤表层会在秋冬季节长出绒毛，依靠绒毛的防寒性能抵御寒冷[10]。季节性换毛是动物为了应对环境温度的变化所作出的适应性反应[11]。合作猪绒毛的生长同样具有季节性，秋季新生绒毛生长出体表，秋冬季快速生长，冬春寒冷季节绒毛密度达到最大，以此抵御寒冷环境气候。本试验利用qRT-PCR方法检测了夏冬两季合作猪颈部、肩部、体侧和臀部皮肤组织中β-catenin基因的表达情况，发现β-catenin基因的表达量夏季高于冬季，且颈部和侧部中β-catenin基因的表达量夏季显著高于冬季（P＜0.05），但肩部和臀部中β-catenin基因的表达量随温度变化较为恒定。以上结果与Plikus等[6]对β-catenin基因在不同季节小鼠皮肤中的变化规律结果相一致，即合作猪皮肤中β-catenin基因的mRNA表达量与温度变化呈正相关。在整个绒毛生长过程中，β-catenin基因的mRNA表达量在夏冬两季存在差异，尤其在冬季绒毛生长发育最迅速的时期，其表达量在颈部和侧部显著降低，但肩部和臀部的表达量与夏季相比较为恒定，表明β-catenin基因的表达可能调控绒毛的发生[12-13]，同时β-catenin基因对毛囊干细胞分化起作用[6]，从而影响绒毛生长，但具体调控机制还有待研究。

4 结论

通过检测夏季和冬季β-catenin基因在合作猪猪体中的表达变化，发现合作猪β-catenin基因在颈部与侧部中的表达量夏季显著高于冬季（P＜0.05）。因此推测β-catenin基因与合作猪周期性绒毛生长有关。本研究结果可为探索合作猪绒毛生长调控分子机制和毛发周期性生长调控机制提供理论依据。