安徽省泛树蛙属物种分类归属初探

梅雅晴，缪永鑫，李艺迪，王陈成，孙 平，王 慧，张保卫*

(1. 安徽大学 生命科学学院，安徽 合肥 230601；2. 蚌埠学院 食品与生物工程学院，安徽 蚌埠 233030)

树蛙科Rhacophoridae属两栖纲、无尾目，包括14个属，440个物种，广泛散布于欧亚大陆[1-2]，中国境内共分布12个属，77个物种[3-4].其中，泛树蛙属Polypedates是Tschudi于1838年以Hylaleucomystax(即现在的Polypedatesleucomystax)为模式种所定义的[5].泛树蛙属的物种指间一般无蹼，头部皮肤多与头骨紧贴，体背面一般为褐色型，多数种有纵条纹或“X”型斑纹[5]，属中的物种广泛分布于印度、婆罗洲以及东南亚等地区[2].由于泛树蛙属内各物种间的差异较小，通过外表、形态差异等很难得到有效的鉴定结果，导致其物种归属以及系统发生关系等问题一直存在争议[6-14].在亚洲地区，部分泛树蛙属的物种被归类为P.leucomystax复合体[5-6,12-13,15-16].Pan等[16]在先前研究的基础上[6-7,15-20]，利用系统发育研究重新评估了该复合体，发现它在东南亚地区含有5个物种，其中有4种在中国境内也有分布[2-3]，分别是布氏泛树蛙P.braueri、斑腿泛树蛙P.megacephalus、无声囊泛树蛙P.mutus和凹顶泛树蛙P.impresus，它们的模式标本产地分别为中国台湾[21]、中国香港[22]、缅甸N’Chang Yang地区[23]和中国云南省普洱市[24].

1974年，四川生物研究所两栖爬行动物研究室在对安徽省两栖爬行动物的调查中，在皖西大别山和皖南黄山地区共发现树蛙科物种两种：大树蛙R.dennysiBlanford和斑腿树蛙R.leucomystax，其中斑腿树蛙为安徽省的分布新纪录[25].出版于1991年的《安徽两栖爬行动物志》中记载安徽省存在树蛙科物种3种，分别为大树蛙、斑腿树蛙和黑点树蛙P.nigropunctatus[26]，其中大树蛙、斑腿树蛙分布于皖西大别山和皖南黄山地区，而黑点树蛙仅记录于皖西丘陵地区分布[26-28].斑腿泛树蛙在皖南分布广泛，2001年唐鑫生等[29]在安徽、江西和浙江三省交界处的安徽岭南自然保护区也有发现.2002年，Wikinson等[15]利用线粒体标记证实了泛树蛙属的有效性，因此将树蛙和泛树蛙区分，斑腿树蛙相应地更名为斑腿泛树蛙Polypedatesmegacephalus[5,26-30].斑腿泛树蛙此后被发现在大别山也是广泛分布的优势种[30-32].

近年来，随着野外调查以及对上述物种的深入研究，学者们对安徽分布的树蛙类不断有新的认识.如原本分布于大别山的黑点树蛙被证实为树蛙科一新种，并被命名为安徽树蛙Rhacophoruszhoukaiya[33].Pan等[16]在2013年通过分子系统发育分析对凹顶泛树蛙的有效性进行研究时，结果显示安徽黄山地区可能有布氏泛树蛙存在.鉴于此前在安徽的皖西大别山和皖南地区并无布氏泛树蛙的报道，其物种的分布及遗传背景现状尚不清楚，因此在安徽分布的泛树蛙属物种有待细致研究，以确定它们在安徽的分布.笔者通过对安徽省大别山地区和皖南黄山地区泛树蛙属样本的采集，结合分子系统发育分析等分析手段，以期厘清安徽分布的泛树蛙属物种，并为泛树蛙属物种的保护和管理等提供研究基础.

1 材料和方法

1.1 样品采集

根据泛树蛙属物种在安徽省内的分布与生境特点，自2013年4月至2016年4月，在皖西地区和皖南地区共选取5个采样点，采集泛树蛙属物种共18只个体，其中皖西大别山地区11只(鹞落坪国家级自然保护区7只、天马国家级自然保护区1只、金寨县金刚台1只、太湖县弥陀镇2只)，皖南黄山地区7只，均采集自黄山风景区周边地区.所采集的样品取部分肌肉组织保存于95%的乙醇溶液中用于后续实验，研究中所有标本都存放于安徽大学生物标本馆内.

1.2 DNA提取、扩增和测序

肌肉组织样品用蛋白酶K消化，并利用酚-氯仿法抽提DNA[34].参考Kuraishi等[6]和Pan等[16]对泛树蛙属系统发育的研究，选取12S rRNA、16S rRNA基因片段作为遗传标记，并使用了两对扩增引物：Rha12S-F: 5’-AAAAGAGCTAACCCGTCTCTGT-3’；Rha12S-R: 5’-CGGTCTGAACTCAGATCACG-3’；Rha16S-F: 5’-GAT ATT AGT CGG CGT TAA GCG TG-3’；Rha16S-R：5’-GCT GCC TTC AGG CCC AC-3’[33,35].PCR反应体系如下：总体积为50 μL，其中DNA模板1 μL，上下游引物(0.2 μmol) 各1 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)25 μL，双蒸水ddH2O 22 μL.PCR反应设置为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35循环，最后一循环保温10 min，4 ℃保存备用.利用未加模板DNA的反应液作为空白对照，以避免实验过程中的污染.

PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，随后送至通用生物系统(安徽)有限公司进行纯化处理后，使用ABI3730 automatic DNA测序仪进行双向测序.

1.3 系统发育分析

使用SeqMan软件对测序结果进行拼接，并辅以人工校对以去除碱基误判等错误，并将整理好的测序结果上传至GenBank，登录号见附录表1.基于Kuraishi等[6]和Pan等[16]此前对泛树蛙属系统发育的研究，并结合安徽省泛树蛙属鉴定所面临的情况，从GenBank中共选择并下载了泛树蛙属10个物种的52条相关序列(12S rRNA，16S rRNA)进行整合分析.其中布氏泛树蛙序列16个；斑腿泛树蛙序列4个；无声囊泛树蛙序列2个；凹顶泛树蛙序列1个；P.leucomystax序列5个；P.otilophus，P.colletti，P.maculatus，P.macrotis序列各1个，以及在Kuraishi[6]研究中，来自Malaysia的一个未知物种P.sp序列2个.在 MEGA 6.0[36]中Clustalx1.81将笔者研究得到的测序结果与来自GenBank的泛树蛙属各物种的同源序列进行比对，并通过手动调整使同源基因的序列长度保留一致.最终得到基因片段的序列长度为1 972 bp，其中12S片段长度为591 bp，16S片段长1 381 bp(附录表1).

构建系统发育树时，以P.otilophus，P.colletti为外群进行系统发育分析.采用贝叶斯推断法(BI)和最大似然法(ML)进行系统发生关系的构建，以确定各个新采集样本的物种归属.构建贝叶斯系统发生树(BI)时，首先在PartitionFinder 2[37]中依据赤池信息准则(AIC)选择最适模型(GTR+I+G)后在MrBayes 3.2[38]中进行建树.运算的代数设置为10,000,000，直至最小的误差值小于0.01，运算中每经历1 000代的运算进行1次采样并保存树图，其中25%的老化结果被舍弃，将剩下的树构建成50%严格一致树，并计算每个节点的后验概率.最大似然树(ML)则通过RaxML软件进行构建，选取GTRCAT作为模型，运算代数为1 000代，以此估计树图各节点的支持率.研究中生成的树文件采用Figtree v1.4.2[39]软件打开，并进行相应的编辑.

此外，研究中还运用MEGA 6.0基于Kimura 2-parameter (K-2-p)对研究中所涉及的各物种之间进行了遗传距离的计算与分析.

2 结果与分析

贝叶斯系统发生树(图1)结果表明，除外群外，树图主要分为了8个支系(CladeA～H)，分别对应于布氏泛树蛙P.braueri、无声囊泛树蛙P.mutus、凹顶泛树蛙P.impresus、斑腿泛树蛙P.megacephalus、P.leucomystax、P.sp.Malaysia、P.macrotis、P.maculatus，并且每一支都得到了较高后验概率的支持.Clade A支系包含了研究中所有来自GenBank的布氏泛树蛙序列(台湾、云南、广西、四川、安徽、福建、浙江、江西)，其中Pan等[16]2013年采集自黄山地区的布氏泛树蛙样品(序列登录号AB564282)也归为该支.不仅如此，研究中所采集的泛树蛙属所有个体(DB1-11、HS12-18)都聚在这一支系之中.代表布氏泛树蛙的这一支与无声囊泛树蛙P.mutus(Clade B，样品来自广西)互为姐妹群.斑腿泛树蛙P.megacephalus(Clade D)在系统树中和P.leucomystax(Clade E，分布于马来西亚等东南亚国家)相聚后再和凹顶泛树蛙P.impresus(Clade C，来自老挝)相聚合，这三者构成一个较大的支系，和上述的“布氏泛树蛙-无声囊泛树蛙”(Clade A+Clade B)支系形成姐妹群关系.上述物种在系统树中，再依次与P.sp.Malaysia(Clade F)，P.macrotis(Clade G)，P.maculatus(Clade H)相聚，构成完整的系统发育树.整体来看，系统发生分析的结果也与Pan等[16]的结果有非常相似的树形拓扑结构.另外，基于最大似然法构建的系统发育树和BI建树结果有着相同的拓扑结构(文中未予展示).

根据系统发生分析结果(图1)，笔者采集自大别山区与皖南山区的泛树蛙样品可归为两个大的支系，整体来看，和来自华东地区(浙江、福建、江西、安徽)的布氏泛树蛙样品(图1中No.12～16)系统关系较为密切.上述样品相聚形成一个大的支系后，再与来自台湾个体相聚(图1中No.10～11).相比之下，他们和采集自云南、广西和四川等地的样品(图1中No.1～9)系统关系相对较远.笔者所采集的所有样品都与斑腿泛树蛙(序列登录号AB564283，AB728034，A8728091，EU215550)的系统位置相去甚远.从遗传距离看，笔者所采集到的18个泛树蛙样品之间的遗传距离为0～0.011，而在Clade A 中，遗传距离的变化为0.028～0.035.另外，这18个样本与研究中的4个斑腿泛树蛙的遗传距离为0.042～0.149(附录表2).上述结果均表明，笔者在皖西大别山区和皖南黄山地区所采集的18只样本均应为布氏泛树蛙，而不是之前认为的斑腿泛树蛙.

研究中所使用的布氏泛树蛙样品分布点用绿色三角形标识(1/2/5/6-云南，3/4-广西，7/8/9-四川，10/11-台湾，12-安徽，13-江西；14-福建；15/16-浙江)；紫色圆点为斑腿泛树蛙分布点(1-泰国、2-香港、3-海南、4-广东)；星号则代表该研究中所采集的样品来源，其中红色为大别山区，黄色为皖南山区.图1 基于线粒体12SrRNA、16S rRNA基因以贝叶斯法构建的泛树蛙属10个物种系统发育树

3 讨 论

据记载，安徽省树蛙科物种共有4种，分别是树蛙属的大树蛙、安徽树蛙，泛树蛙属的斑腿泛树蛙、布氏泛树蛙[5,16,26].其中大树蛙被记载分布于霍山、金寨、泾县、祁门、青阳、东至[26]；安徽树蛙目前在大别山安徽境内高海拔地区皆有分布[33].据记载，斑腿泛树蛙分布于黄山、九华山以及大别山地区[26-32]，而布氏泛树蛙近年才在黄山有记录[16].从目前的相关资料[5,12-14,25-31]来看，斑腿泛树蛙和布氏泛树蛙在形态、繁殖方式、生活方式上都很接近，仅依靠形态学很难获得准确的鉴别结果.笔者通过在皖南山区和大别山区的系统调查取样，利用分子系统学的研究手段，通过与泛树蛙属的相关近缘物种进行比较分析，发现研究中采自皖南山区和大别山区所有泛树蛙样品都应是布氏泛树蛙.

通过对文献的总结，发现布氏泛树蛙的分布范围较广，目前在广西、广东、云南、四川、贵州以及与安徽相邻的浙江、江西、福建等省均有分布[4-6,16,19,41].此外，Pan等[16]在2013年的研究表明布氏泛树蛙在安徽皖南山区有分布.而斑腿泛树蛙则分布于西南地区的云南、广西、海南、四川、贵州等省份[4-6,16,40-41]，空间分布与安徽省距离甚远.因此笔者认为，安徽省范围内可能并无斑腿泛树蛙分布，此前所记载的斑腿泛树蛙[25-32]应该是对布氏泛树蛙的误判.研究的结果还提示布氏泛树蛙在安徽省范围内的分布广泛，它在大别山区以及皖南山区均为常见物种[5,25-32].

根据文中对布氏泛树蛙的谱系地理关系分析，我国的布氏泛树蛙很可能起源于云南、广西、四川一带，并逐渐向我国东南部(浙江、江西、安徽、福建)扩散，并在此南下到达台湾、北向越过长江到达大别山地区.作为广泛分布的泛树蛙类物种，布氏泛树蛙的种群遗传特征和谱系地理发生过程值得进一步研究.