基质固相分散和HPLC-IT-TOF/MS联用研究漆树木材中多酚成分

陈虹霞， 周 昊,2， 陶 冉, 齐志文， 李文君， 王成章,2*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室；江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210042; 2.中国林业科学研究院 林业新技术研究所，北京 100091)

漆树是一种落叶乔木，属于漆树科漆树属，在东亚地区常常把它作为中草药用于治疗胃肠炎、心脏病、关节炎、高血压、糖尿病、中风和慢性疲劳综合征[1-2]。据报道，漆树提取物具有明显的抗氧化、抗菌、抗炎和抗肿瘤作用[3-5]。目前主要采用热回流浸提法、超声波辅助萃取法和负压提取等工艺对漆树中的活性成分进行分析、分离和活性评价，这些方法通常需要大量的样品和溶剂、较高的提取温度和较长的提取时间[6-7]。因此，建立一种简单、快速的提取方法对于漆树提取物的质量评价和后续分析具有重要的意义。基质固相分散(MSPD)，由Barker于1989年提出，广泛用于生物和食品样品中化合物的提取和分析[8]。 MSPD已成功应用于粉尘中多溴联苯醚[9]、农作物中的黄曲霉毒素[10]、酿造酵母剩余物中的酚类化合物[11]和冷冻家禽中的抗生素残留[12]等样品色谱分析前的提取。高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(HPLC-IT/TOF-MS)提供离子阱的MSn表征能力和TOF的高分辨率，以及质量精度能力，是一种理想的结构鉴定工具，具有灵敏度高、分辨率高、质量精度高和质量范围较宽的优点[13-14]。采用MSPD的方法提取漆树木中的酚类化合物，可以实现样品的单步骤提取和净化，具有操作简单、溶剂消耗少和耗时短的优势；HPLC-IT/TOF-MS的分析方法，具有精准提供化合物结构信息的能力，有利于漆树木中化合物的识别。因此，本研究采用基质固相分散提取漆树木中的多酚化合物，通过单因素试验对工艺过程进行优化，然后利用HPLC-IT/TOF-MS技术采集提取物中化合物的质谱信息，通过裂解规律和文献参考对漆树中多酚化合物的化学成分进行分析。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

漆树木树干，来自于陕西商洛，自然晾干，粉碎成粉末，测定水分为8.28%， 过0.85 mm的筛，备用。硅胶C18、C8购于大连依利特分析仪器有限公司；硅藻土、壳聚糖、酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、乙腈、福林-乔卡尔特马(FC)试剂和Na2CO3购于国药集团化学试剂有限公司；分子筛ZSM-22和ZSM-5购于阿拉丁生化科技股份有限公司；没食子酸购于Sigma公司。

高效液相色谱-离子阱-飞行时间型质谱(HPLC-IT-TOF/MS)仪，LC-20A高效液相色谱(HPLC)仪，日本岛津公司；MultiskanGO型酶标仪，赛默飞世尔科技公司。

1.2 没食子酸标准曲线的绘制

精确称取没食子酸标准品10 mg，加入蒸馏水溶解并定容到100 mL，得到0.1 g/L的标准品标准溶液。分别移取0、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8和1 mL的0.1 g/L的标准溶液至10 mL的容量瓶中，分别加入1 mL的 0.2 mol/L FC试剂和2 mL的15% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至刻度，常温反应2 h，在760 nm处测吸光度。绘制吸光度与浓度的标准曲线，并拟合线性回归方程，得到回归方程为：Y=0.062X+0.005 2，相关系数R=0.999 1。没食子酸在10～100 μg区间内具有良好的线性关系。

1.3 基质固相分散(MSPD)提取

1.3.1提取 称取漆树木粉末0.2 g，加入吸附剂置于研钵中，用研杵使其混匀并研磨完全后，将混合物转入到底部垫有脱脂棉的10 mL注射器中，顶部加入脱脂棉，压实。用溶剂进行洗脱，收集洗脱液，并用10 mL的容量瓶定容，过0.45 μm的滤膜，用于多酚含量的测定。

1.3.2多酚含量测定 将1.3.1节收集的洗脱液稀释至原体积的25倍，取0.2 mL于10 mL的容量瓶中，分别加入FC试剂和15% Na2CO3溶液，在760 nm下测定吸光度。漆树多酚得率以每克样品中没食子酸(GAE)的质量来表示。

1.3.3单因素试验 根据单因素试验设计，选取了5个因素，分别为：吸附基质种类、吸附剂与样品的比例、洗脱溶剂种类、研磨时间和洗脱溶剂用量进行基质分散提取试验。考察不同因素对漆树木多酚提取得率的影响。

1.4 表征分析

1.4.1色谱条件 色谱柱(250 mm×4.6 mm,4 μm)；流动相为乙腈(A)/0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～20 min，90%～75%B；20～30 min，75%～60%B；30～40 min，60%～5%B；柱温30 ℃；流速0.3 g/L；进样量4 μL；检测波长280 nm。

1.4.2质谱条件 ESI离子源；检测模式为正、负离子化；雾化气为高纯氮气，流速1.5 L/min；离子积累时间10 ms；曲形脱溶剂管(CDL)和加热模块(BH)温度为200 ℃; CID能量为50%；检测器电压为1.60 kV；MS检测范围m/z100～600。

2 结果与讨论

2.1 MSPD条件对漆树木多酚提取的影响

2.1.1吸附基质种类 吸附基质的选择，在基质固相分散提取中起着重要的作用，根据所提取化合物的极性和性质，选择合适的吸附基质可以有效地提取目标物质，分离干扰物质。固定吸附基质与样品的质量比为3 ∶2，洗脱溶剂为甲醇，洗脱溶剂用量10 mL，研磨时间2 min，考察9种吸附基质对漆树木多酚提取的影响。其中，分子筛ZSM-22对漆树木多酚的提取得率最高，为432.88 mg/g，其次是硅藻土、硅胶C8和硅胶C18(407.76、 388.67和372.59 mg/g)，分子筛ZSM-5和壳聚糖的漆树木多酚提取得率分别为261.05和237.94 mg/g，而氧化铝的效果最差，酸性、中性和碱性氧化铝的多酚提取得率分别为207.80、 163.59和168.61 mg/g。

ZSM-22是一种高硅铝比分子筛，具有特殊的孔道结构和较高的比表面活性，这些原因有助于提高提取效率。硅藻土的化学成分主要是SiO2，它比较容易与多酚类化合物的极性基团形成氢键，另外一方面硅藻土的孔隙较大，吸收性强，也有助于提高提取效率。而氧化铝效果较差，可能是漆树木中的黄酮类化合物与铝形成络合物，牢固地吸附在小柱上，使得溶剂很难洗脱。因此，选择ZSM-22作为吸附基质。

2.1.2吸附基质与样品的质量比 适当的吸附基质与样品的质量比可以有效地减少吸附基质对样品结构的破坏，增加洗脱溶剂与目标化合物的接触面积，提高MSPD的提取效率。固定吸附基质为ZSM-22，洗脱溶剂为甲醇，洗脱溶剂用量10 mL，研磨时间2 min，考察不同吸附基质与样品的质量比(1 ∶2、 1 ∶1、 3 ∶2、 2 ∶1、 5 ∶2和3 ∶1)对漆树木多酚提取的影响。图1(a)的结果表明：随着吸附基质比例的提高，MSPD对漆树木多酚的提取得率增大，这是由于吸附基质与多酚化合物的接触面积变大，从而增大了吸附基质的吸附能力。当质量比达到2 ∶1时，提取效率最高，进一步增加吸附基质的比例，提取效率略微下降，这可能是样品中多酚的吸附量已经达到饱和，而过多的吸附基质，使得溶剂很难完全将酚类物质洗脱，导致提取得率下降。因此，选择吸附基质与样品的质量比为2 ∶1。

2.1.3洗脱溶剂种类 洗脱是从固相萃取柱中解吸目标化合物的过程。因此，洗脱溶剂的极性和目标化合物在洗脱溶剂中的溶解度直接影响洗脱效率。固定吸附基质为ZSM-22，吸附基质与样品的质量比为3 ∶2，洗脱溶剂用量10 mL，研磨时间2 min，考察6种洗脱溶剂(甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水、乙腈和正丁醇)对漆树木多酚提取的影响。甲醇表现出最佳的洗脱效率，多酚提取得率432.88 mg/g；其次是水(290.19 mg/g)和乙醇(246.99 mg/g)。乙酸乙酯、乙腈和正丁醇的多酚提取得率分别为58.60、 127.73和73.87 mg/g。这是由于漆树木多酚化合物包含很多酚羟基，与甲醇之间具有很好的相似相溶性。考虑到水是除甲醇外，相对较好的洗脱溶剂。进一步对不同的甲醇体积分数进行研究，结果见图1(b)。

由图可知，随着甲醇体积分数的提高，MSPD对漆树木多酚的提取得率先增大后减小，甲醇体积分数在70%时，多酚提取得率最高。与甲醇相比，体积分数70%的甲醇水溶液具有更高的极性，更容易打破酚类物质与ZSM-22之间的相互作用，利于多酚类化合物的解吸。因此，选择体积分数70%的甲醇作为洗脱溶剂。

2.1.4研磨时间 通过研磨可以改变样品的大小，使样品与吸附基质充分接触，促进目标化合物与吸附基质的相互作用。固定吸附基质为ZSM-22，吸附基质与样品的质量比为3 ∶2，洗脱溶剂为体积分数70%的甲醇，洗脱溶剂用量10 mL，考察研磨时间(0、 1、 2、 3和4 min)对漆树木多酚提取的影响。由图1(c)可知，随着研磨时间的增加，漆树木多酚提取得率先增大，这是由于研磨使漆树木的组织变小，与ZSM-22之间的接触面积变大。当研磨时间为2 min时，提取效果最好，进一步延长研磨时间，漆树木多酚提取得率略微下降，这可能是由于长时间地研磨，使多酚类化合物牢固吸附在ZSM-22上，从而阻止了洗脱溶剂的洗脱。因此，选择2 min作为最佳研磨时间。

2.1.5洗脱溶剂用量 洗脱溶剂用量是影响MSPD提取效率的重要因素。固定吸附基质为ZSM-22，吸附基质与样品的质量比为3 ∶2，洗脱溶剂为体积分数70%的甲醇，研磨时间2 min，考察洗脱溶剂用量(2、 4、 6、 8和10 mL)对漆树木多酚提取的影响，结果见图1(d)。

a.吸附基质/样品质量比mass ratio of sample to adsorbent; b.甲醇体积分数methanol volume fraction;

随着洗脱溶剂用量的增大，漆树木多酚提取得率先增大后趋于平缓。考虑到洗脱溶剂用量即要满足样品能够完全洗脱，也要尽量少的使用洗脱溶剂，因此，选择8 mL为最佳的洗脱溶剂用量。根据单因素试验结果，得到漆树木多酚基质固相分散提取的最佳工艺条件为：ZSM-22为吸附基质，吸附基质与样品的质量比为2 ∶1，洗脱溶剂为体积分数70%的甲醇，洗脱溶剂用量8 mL，研磨时间2 min。在此条件下，进行平行3次平行实验，漆树木多酚提取得率为(466±2.05) mg/g。

2.2 HPLC-IT-TOF/MS表征结果

2.2.1总离子流图分析 应用HPLC-IT-TOF/MS技术对由基质固相分散提取的漆树木提取物进行分析，漆树木提取物在正负离子下的总离子流图见图2。根据飞行时间质谱的正、负离子模式测得的准分子离子峰和碎片离子峰，通过质谱裂解规律和相关文献数据推测漆树木提取物中的多酚成分的结构，共鉴定出10个化合物，包括3个酚酸类化合物和7个黄酮类化合物。各化学成分的保留时间、质谱数据见表1。

图2 漆树木提取物的HPLC-IT-TOF/MS总离子流图

表1 漆树木提取物的HPLC-IT-TOF/MS分析

2.2.2酚酸类化合物鉴定 峰1，保留时间为1.133 min，在飞行时间质谱负离子模式下得到准分子离子峰为m/z169.017 3[M-H]-，其二级质谱得到m/z125.027 7[M-H-COO]-的碎片峰，与没食子酸质谱数据一致，推断峰1为没食子酸。峰2，保留时间为3.187 min，在飞行时间质谱负离子模式下得到准分子离子峰为m/z183.032 1[M-H]-, 预测分子式为C8H8O5，其二级质谱得到m/z125.019 2[M-H-COOCH2]-的碎片峰，与没食子酸甲酯的质谱数据一致，推断峰2为没食子酸甲酯。峰3，保留时间为6.200 min，在飞行时间质谱负离子模式下得到准分子离子峰为m/z197.048 2[M-H]-, 预测分子式为C9H10O5，其二级质谱得到m/z169.017 1[M-H-C2H4]-和124.975 9[M-H-C2H4-COO]-的碎片峰(见图3)，该化合物的二级质谱得到的数据与没食子酸相似，推断峰3为没食子酸乙酯。

图3 没食子酸乙酯和没食子酸甲酯的裂解规律图

2.2.3黄酮类化合物的鉴定 峰4，保留时间为7.400 min，在飞行时间质谱正离子模式下给出准分子离子峰为m/z289.070 3[M+H]+，在飞行时间质谱负离子模式下给出准分子离子峰为m/z287.056 4[M-H]-，预测分子式为C15H12O6。在负离子模式下二级质谱可见m/z269.049 7[M-H-H2O]-、 254.930 2[M-H-H4CO]-和226.980 3[M-H-H4CO-CO]-碎片离子。m/z150.993 5碎片离子是由m/z287.056 4经过1,3A的RDA裂解产生的(见图4)。根据表1数据以及结合文献[15]，推断峰4为黄颜木素。

图4 黄颜木素的裂解规律图

峰5，保留时间为9.587 min，在飞行时间质谱正离子模式下给出准分子离子峰为m/z305.066 8[M+H]+，在飞行时间质谱负离子模式下给出准分子离子峰为m/z303.052 1[M-H]-，预测分子式为C15H12O7，在负离子模式下二级质谱可见m/z275.053 2[M-H-CO]-、 271.060 4[M-H-H4CO]-和242.919 3[M-H-H4CO-CO]-碎片离子。m/z179.025 4 碎片离子是由m/z303.052 1经过1,2A的RDA裂解产生的，而m/z150.993 3碎片离子是由m/z179.025 4 通过丢失中性分子CO得到的(见图5)。根据表1数据以及结合文献[16]，推断峰5为花旗松素。

图5 花旗松素的裂解规律图

峰6，保留时间为10.760 min，在飞行时间质谱正离子模式下给出准分子离子峰为m/z273.075 5[M+H]+，在飞行时间质谱负离子模式下给出准分子离子峰为m/z271.063 1[M-H]-，预测分子式为C15H12O5，在负离子模式下二级质谱可见m/z243.066 9[M-H-CO]-、 238.931 2[M-H-H4CO]-和226.980 1[M-H-H4CO-C]-碎片离子。m/z162.994 9碎片离子为m/z271.063 1经过1,2A的RDA裂解产生的(见图6)。根据表1数据以及结合文献[17]，推断峰6为3,4′,7-三羟基黄烷酮。

图6 3,4′,7-三羟基黄烷酮的裂解规律图

峰7，保留时间为11.933 min，在飞行时间质谱正离子模式下给出准分子离子峰为m/z317.065 1[M+H]+，在飞行时间质谱负离子模式下给出准分子离子峰为m/z315.051 2[M-H]-，预测分子式为C16H12O7，在负离子模式下二级质谱可见m/z301.047 9的碎片离子，为化合物丢失一个CH2的碎片离子，推测化合物含有甲氧基团。在负离子模式下二级质谱可见m/z255.042 0为m/z301.047 9的碎片离子丢失中性分子H2O和CO的碎片离子。m/z178.929 9和150.993 3为m/z301.047 9的碎片离子发生1,2A和1,3A的RDA裂解产生的(见图7)。根据表1数据以及结合文献[18]，推断峰7为异鼠李素。

图7 异鼠李素的裂解规律图

峰8，保留时间为13.453 min，在飞行时间质谱正离子模式下给出准分子离子峰为m/z449.107 0[M+H]+，在飞行时间质谱负离子模式下给出准分子离子峰为m/z447.094 1[M-H]-，预测分子式为C21H20O11，在负离子模式下二级质谱可见m/z300.027 3，为槲皮素苷元失掉一个氢离子的离子峰，由此可以推测该化合物为槲皮素糖苷类化合物，根据丢失的相对分子质量146推测为鼠李糖(C6H10O4)。m/z255.047 1为槲皮素苷元丢失中性分子CO和OH产生的碎片离子，m/z271.220 6为槲皮素苷元丢失中性分子CHO产生的碎片离子，m/z242.935 9为碎片离子进一步裂解丢失中性分子CO产生的(见图8)。根据表1数据以及结合文献[19]，推断峰8为槲皮苷。

图8 槲皮苷的裂解规律图

峰9，保留时间为14.720 min，在飞行时间质谱正离子模式下给出准分子离子峰为m/z287.055 2[M+H]+，在飞行时间质谱负离子模式下给出准分子离子峰为m/z285.040 5[M-H]-，预测分子式为C15H10O6，在负离子模式下二级质谱可见m/z257.092 3[M-H-CO]-和228.980 5[M-H-CO-CO]-碎片离子，m/z162.994 2为准分子离子峰m/z285.040 5发生1,2A的RDA裂解产生的碎片离子峰(见图9)。根据表1数据以及结合文献[20]，推断峰9为漆黄素。

图9 漆黄素的裂解规律图

峰10，保留时间为17.920 min，在飞行时间质谱正离子模式下给出准分子离子峰为m/z271.059 7[M+H]+，在飞行时间质谱负离子模式下给出准分子离子峰为m/z269.045 4[M-H]-，预测分子式为C15H10O5，在负离子模式下二级质谱可见m/z240.924 1[M-H-CO]-和222.980 9[M-H-CO-H2O]-碎片离子。m/z136.994 3为准分子离子峰发生1,2A的RDA裂解产生的碎片离子峰(见图10)。根据表1数据以及结合文献[21]，推断峰10为硫黄菊素。

图10 硫黄菊素的裂解规律图

2.3 方法比较

为了进一步评价该方法的优势，将样品用量、分析物、提取方法、溶剂、提取时间与其他文献方法进行了比较，结果列于表2中。

表2 提取方法比较

采用热回流提取[6,15]，负压提取[7]与LC-MS联用已用于漆树木中化合物的提取与分析，然而这些方法通常比较耗时，提取温度也较高，并且需要大量的提取溶剂才能分析目标化合物。而本研究方法与其他几种方法相比，具有样品用量少、溶剂用量少、提取时间短和常温提取的优点，所以采用MSPD是一个高效快捷的漆树样品预处理方法，与HPLC-IT-TOF/MS联用，为漆树木中酚类化合物的分析提供了更好的检测效果。

3 结 论

3.1建立基质固相分散(MSPD)提取漆树木中多酚类化合物的方法，根据单因素试验结果，漆树木多酚MSPD提取的最佳工艺条件为：ZSM-22为吸附基质，吸附基质与样品的质量比为2 ∶1，洗脱溶剂为体积分数70%甲醇，洗脱溶剂用量8 mL，研磨时间2 min。在此条件下，漆树木多酚提取得率为(466±2.05) mg/g。

3.2采用HPLC-IT-TOF/MS联用技术对漆树木多酚化合物的化学组成进行了分离及鉴定，根据各个色谱峰在质谱中的相对分子质量、碎片信息和裂解规律，鉴定了10个化学成分，分别为没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、黄颜木素、花旗松素、 3,4′,7-三羟基黄烷酮、异鼠李素、槲皮苷、漆黄素和硫黄菊素。