液体活检在胰腺癌诊疗中的应用

李洪祯 沈珊珊

南京大学医学院附属鼓楼医院消化内科，南京 210008

【提要】 液体活检是一类新兴和热门的无创肿瘤检测技术，主要包括循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤RNA(ctRNA)、外泌体等的检测。除外周血以外，内镜技术的进步使得对胰液、门静脉血等体液来源进行液体活检成为可能。近年来液体活检在胰腺癌的早期筛查、早期诊断、肿瘤分层、肿瘤复发检测以及治疗反应预测等方面显示出无可比拟的优势。本文重点讨论液体活检在胰腺癌诊治中的应用现状及未来的机遇和挑战。

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，5年生存率仅为10%[1]，早期诊断和个体化治疗对提高胰腺癌患者生存期至关重要。液体活检作为一种无创肿瘤检测技术，通过检测人体体液中存在的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)、循环肿瘤RNA(circulating tumor RNA, ctRNA)、外泌体等成分，在胰腺癌的早期筛查、诊断、肿瘤分层以及治疗反应监测中具有极大的应用前景。借助液体活检，有望实现对胰腺癌进行更加精准的分子诊断，从而指导治疗决策和预后。随着EUS、ERCP等内镜技术的发展，人们更容易获取胰液、门静脉血等替代的体液来源用于分析；但受限于现有研究结果的敏感性不高、可重复性差，目前仍没有一种有效的液体活检手段应用于胰腺癌的临床诊疗流程。要实现液体活检从科研探索到临床应用的转化，需要科研人员和临床医师对检测手段的可行性、可重复性和成本效益等方面进行综合评估。本文着重讨论液体活检在胰腺癌诊疗中的应用。

一、液体活检的技术手段

1.ctDNA检测：既往对胰腺癌组织进行DNA测序明确了胰腺癌的4个驱动基因，即Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS)、p53肿瘤蛋白(tumor protein p53, TP53)、细胞周期依赖激酶抑制剂2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A, CDKN2A)和SMAD同源蛋白4(SMAD family member 4, SMAD4)，这些基因突变可在胰腺癌发生的不同阶段被检测到[2]，其中90%以上的胰腺癌患者肿瘤组织可检出KRAS突变。人体液中包含由凋亡或者坏死的细胞释放的游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)，其中包括来源于原发和(或)转移病灶脱落的ctDNA，可以检测到肿瘤特征性的突变。ctDNA的检测技术一般可分为靶向测序技术和非靶向测序技术，前者基于微滴数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)技术，具有更高的灵敏度和特异度，但仅能检测特定的已知突变；后者基于二代测序技术，具有更高通量，可以检测未知的突变、结构变异和拷贝数变异，但灵敏度略低。ctDNA片段在循环中的半衰期很短，从16 min到数小时不等[3]，这也给ctDNA突变的检测带来了挑战。

在胰腺癌相关的研究中，KRAS突变最常应用于ctDNA的检测，其灵敏度在50%～70%不等[4-5]。近年来ctDNA分析技术取得了飞速进展，通过改进ctDNA检测方法，例如基于单链建库和测序方法，较传统的二代测序和ddPCR技术，可以使早期胰腺癌患者中KRAS突变的检出率提高20%[6]。但由于体液中ctDNA丰度受多种因素的影响，以及小部分不携带KRAS突变胰腺癌患者的存在，这一比例很难再有所突破。笔者所在课题组最新研究发现，中国人群不携带 KRAS突变的胰腺癌患者比例更高，可达到20%左右，且早期胰腺癌患者的外周血中KRAS突变的检出率较低(30%～68%)，使得外周血的KRAS突变检测很难用于胰腺癌的早期筛查。

ctDNA还可以用于对胰腺癌患者治疗反应的预测。体液中ctDNA比蛋白标志物变化更迅速，治疗期间突变KRAS ctDNA水平的变化是治疗反应的早期指标[7-8]。此外，ctDNA还可用于检测微小残留病灶和预测肿瘤复发，术后检测到KRAS ctDNA突变的患者，肿瘤复发率更高[4]。

2.外泌体检测：外泌体是由多种机体细胞或肿瘤细胞分泌并释放到各种体液中的一种细胞外囊泡,直径40～100 nm，具有脂质双层膜结构，并携带细胞特异的蛋白、脂质和核酸[9]。研究发现，通过蛋白质组学对血浆来源的外泌体进行分析可以识别特定的癌症类型和肿瘤[10]。外泌体的提取有多种方法，包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法，以及特定抗体免疫亲和捕获法。外泌体的分析主要是对外泌体组成成分包括DNA、RNA和蛋白质的检测，其优势在于外泌体结构的循环稳定性。研究发现外泌体内RNA类物质如miR-10b[11]、蛋白质类如磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1, GPC1)[12]等标志物对鉴别胰腺癌具有较高的灵敏度和特异度。利用多种外泌体来源的生物标志物的组合可以进一步提高诊断胰腺癌的灵敏度和特异度[13]。

3.CTCs检测：CTCs是指肿瘤原发灶或者转移灶脱落的肿瘤细胞进入循环系统，其在外周血有核细胞中占有量极少，每106～8个白细胞中仅含10～100个CTCs。理论上CTCs可以来源于多个肿瘤区域以及远处转移灶，相较于单一位点的组织活检，CTCs更能反映肿瘤的全貌和一致性，使得CTCs检测在肿瘤早期诊断、残留病灶检出、治疗反应监测等方面具有广阔的应用前景。CTCs的检测可以通过RT-PCR手段或基于抗原抗体捕获技术，随着技术的发展，CTCs富集手段不断进步。目前最常应用的CellSearch是唯一被美国食品药品监督管理局批准用于检测血液中CTCs的标准技术，该技术利用包被上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗体的免疫纳米颗粒捕获CTCs[14]。

在胰腺癌领域，研究者发现约42%的患者在外周血中可以检测到至少1个CTCs，但CTCs阳性通常预示着进展期病变和更短的生存期，因此对于早期胰腺癌患者或交界可切除的胰腺癌患者，CTCs的检测价值可能不高[15]。在一项纳入75例局部晚期胰腺癌患者的多中心研究中，仅有5%的患者可以检测到CTCs[16]。

二、液体活检的体液来源

作为消化器官，胰腺相关的液体活检取材来源广泛。由于侵入性极小，获取方便，外周血是液体活检来源的首选。然而，在胰腺恶性肿瘤中，尽管肿瘤物质富集技术取得了进展，但外周血分析仍然依赖于肿瘤负荷的程度。在胰腺癌广泛转移之前，外周血中肿瘤来源的成分一直非常低，因此寻找可替代的含有肿瘤特异性物质更多的体液来源是拓展液体活检在胰腺癌中应用的重要途经。除常规利用的外周血、尿液和唾液外，还可以利用胰液、门静脉血以及囊液等进行液体活检，但这些液体的获取具有一定的侵入性和操作难度。

1.胰液：胰液是由胰腺分泌的消化液，是胰腺癌相关的液体活检最好的体液，理论上包含更多肿瘤细胞来源的DNA、RNA、蛋白质和外泌体，对其检测有可能提高这些生物标志物的灵敏度和特异度[17]。国外报道常用的胰液获取的方式是通过ERCP技术插入造影剂导管负压抽吸胰液，同时应用促胰液素可获取更多的胰液，但目前促胰液素在我国尚未应用，且考虑到ERCP术后有1%～25%的患者有胰腺炎的并发症，因此ERCP手段收集胰液具有一定的风险性。内镜下鼻胰管引流(endoscopic nasopancreatic drainage, ENPD)是另外一种在临床上收集胰液的方法，ENPD管可以在主胰管放置3 d，这种方式可以持续引流大量胰液用于后续分析[18]。与其他液体活检类似，胰液可以进行CTCs、ctDNA、ctRNA和外泌体分析。由于胰液中富含消化酶，因此需要关注样本收集的时效性[19]，警惕降解的可能，收集后立刻放在深低温冰箱储存，并且加入蛋白酶抑制剂或RNA稳定剂以防止待测物质降解。

胰液中KRAS突变检测诊断胰腺癌的灵敏度在66%～100%，诊断胰腺导管内乳头状黏液肿瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)的灵敏度为60%～92%[18]。部分蛋白质标志物如S100钙结合蛋白P(S100 calcium binding protein P, S100P)、黏蛋白1(mucin1, MUC1)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、白介素8(interleukin 8, IL8)，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)和黏蛋白5AC(mucin 5AC, MUC5AC)等在胰腺癌患者来源的胰液中的水平增加[20-21]。此外，胰液外泌体中包含的核酸和蛋白质类物质较为稳定，因此分离胰液中外泌体进行检测理论上具有更高的价值[22]。笔者所在课题组通过ENPD方式收集的胰液可以成功地提取外泌体，发现胰腺癌患者胰液中的外泌体蛋白含量较胰腺良性肿瘤患者明显增多。

2.门静脉血：门静脉血是另外一种可行的胰腺癌液体活检的样本来源。由于肝脏是胃肠道静脉经门静脉系统引流血液的首个器官，临床上大多数胃肠道恶性肿瘤(胰、胆、结肠)远处转移扩散最常见的部位是肝脏。由于胰腺静脉血液首先流入肝脏，在肝脏的过滤作用后进入外周，使得更靠近胰腺的门静脉血中富含更多的胰腺癌来源的物质。门静脉血的获取主要依赖术中或者EUS引导下细针穿刺活检(EUS-guided fine needle aspiration, EUS-FNA)技术，目前技术成熟，安全可靠，但操作难度相对较高。

门静脉血在CTCs检测中具有较大的优势，平均每7.5 ml血液可以获取(118.4±36.8)个CTC，是外周血含量的100多倍[23]。在可切除或交界可切除胰腺癌患者中，门静脉血CTCs数值略低，约83.2个/7.5 ml[24]。即便如此，多项研究发现门静脉血CTCs在96%～100%的胰腺癌患者中均可以检测到[23,25]。门静脉血CTCs数值更高的患者发生肝转移的风险更高[26]。笔者所在课题组的一项新近研究发现，31例胰腺癌患者有30例可以在门静脉血中检测到CTCs，27例在外周血中检测到CTCs，且门静脉血中CTCs数量较外周血明显增加。TWIST阳性的间质型CTCs较EpCAM阳性的上皮型CTCs与患者的肿瘤负荷和预后显著相关[27]。Kawamura等[28]报道，胰腺癌患者门静脉血的外泌体内的某些miRNA如miR-4525、miR-451a和miR-21较外周血更高，可作为胰腺癌患者预后的标志物。

三、液体活检在胰腺癌诊疗中的应用

1.胰腺癌的筛查：近期由南京大学医学院附属鼓楼医院消化科牵头的《中国胰腺癌高危人群早期筛查和监测共识意见》[29]指出，对具有遗传性胰腺癌家族史的高危个体，例如Peutz-Jeghers综合征的患者[种系丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶11(serine-threonine kinase 11, STK11)基因突变携带者]、CDKN2A基因突变携带者以及阳离子胰蛋白酶原基因(cationic trypsinogen gene, PRSS1)突变的常染色体显性遗传性胰腺炎患者，应进行胰腺癌早期筛查。基于外周血样本的二代测序技术对于明确是否携带上述基因突变至关重要，有助于筛选和富集胰腺癌高危人群，纳入后续筛查流程。

2.胰腺癌的诊断：临床上胰腺癌的诊断依赖于影像学检查和EUS-FNA获取组织进行肿瘤活检，但EUS-FNA面临假阴性的问题，有时即使重复活检，仍然难以获取肿瘤细胞用于诊断。液体活检是胰腺癌诊断的重要补充手段。但目前为止，回顾大量胰腺癌液体活检相关的研究，即便是同一种标志物，在胰腺癌诊断中的效能在不同的研究中差异很大，结果一致性低。为了提高液体活检在胰腺癌诊断中的检出率，其中一种策略是将不同类型的液体活检手段比如DNA、RNA、蛋白等结合起来，以捕获更多肿瘤的生物学特征。一项研究中联合两种外泌体来源的蛋白(GPC1和CD63)在区分胰腺癌和健康人群的灵敏度和特异度可以达到99%和82%[30]。另一项纳入501例患者的研究中，作者开发了一种含有8个来自血浆外泌体的长链非编码RNA组合能够识别可切除的Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌患者(AUC=0.949)[31]。

3.胰腺癌手术和复发监测及治疗应答：胰腺癌治疗决策选择的关键是对可切除性的判断，主要取决于局部血管受累程度和有无远处转移。影像学是用于评估患者能否切除的最佳手段，但部分微小转移灶很难通过影像学发现[32-33]。在可切除胰腺癌患者中，约有60%的胰腺癌患者术后3年内复发，这可能提示这些患者在手术切除之前已发生微小转移。研究发现液体活检有助于发现这些隐匿性转移性病灶的潜力，从而使患者避免不必要的手术带来的并发症。相对于原发灶，ctDNA被证实与远端转移灶突变一致性更高[33]。很多研究探究了液体活检手段在胰腺癌术后复发检测中的价值。据报道，术前检测到KRAS突变的可切除胰腺癌患者术后复发风险更高，若术后突变KRAS ctDNA转阴，复发风险也相应下降[4]。与之类似，术后CTCs阳性患者发生转移风险也更高[34]。此外，也有报道，一些miRNA(如miR-373-3p、miR-744、miR-415a)[35]、蛋白标志物(如GPC1)[36]等也可用于胰腺癌复发检测。

仅有局部病变但伴有周围大血管浸润的胰腺癌患者可进一步根据受累程度分为交界性可切除胰腺癌和局部晚期胰腺癌，这一类患者有可能经过术前新辅助放化疗增加根治性切除的概率。目前新辅助化疗后治疗反应的检测手段有限，主要依据影像学和CA19-9，难以准确评估。研究发现CTCs和ctDNA可以有效预测新辅助化疗患者的治疗反应和复发[37]，新辅助化疗后仍检测到ctDNA的患者提示疾病发生进展[8,38]。此外，有研究还利用液体活检手段进行化疗敏感度的验证。在不可切除的胰腺癌患者中，通过分离CTCs细胞和构建药物基因组学模型预测不同化疗方案的疗效，可以显著提高患者的生存期[38]。在一项纳入38例接受FOLFIRINOX一线化疗的晚期胰腺癌患者的研究中，ctDNA检出的增加与患者化疗耐药和病情进展有关[39]。

四、液体活检的多种标志物联合和评分系统

多项胰腺癌的液体活检研究数据发现单一的标志物很难满足临床上对胰腺癌诊治的要求，因此开发多种标志物联合的液体活检是目前液体活检研究的方向之一。有研究利用外周血的蛋白标志物和ctDNA开发了一种工具“CancerSEEK”，对包含胰腺癌在内的5种癌症的早期诊断特异性为69%～90%[40]。另外一项研究利用包含29种蛋白的微阵列可以有效将Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌患者与健康对照组区分开来(AUC=0.96)[41]。CA19-9作为一种临床上广泛应用的糖类抗原标志物，临床价值有限。现有研究探讨了CA19-9联合血清学或胰液中其他标志物，如代谢标志物[42]、DNA甲基化[43]、miRNAs[13]、蛋白[21]等，可以实现更高的准确性和灵敏度。有研究通过患者尿液中的3种蛋白标志物建立胰腺癌风险评分“PancRISK”，可将早期胰腺癌检测的灵敏度和特异度提高到85%以上[44]。此外，机器学习是近年来肿瘤早期诊断的热门研究领域，通过多种类型的生物学标志物，包括CA19-9、KRAS突变联合部分蛋白、RNA等，利用机器学习建立预测模型，准确性高达92%[45]。

综上所述，未来提高胰腺癌生存期的有效策略是更早地发现病变，更加精准的治疗决策以及动态化的肿瘤检测。液体活检具备实时动态检测、克服肿瘤异质性、提供全面检测信息等独特优势，在未来极有可能被纳入胰腺癌的综合诊疗过程，为达到上述目标提供有价值的信息，实现更加精准的“分子诊断”。遗憾的是，截至目前仍没有一种液体活检手段应用于临床。笔者认为，如何克服当前液体活检手段的敏感度差、规范性和可重复性不佳、经济效益低等瓶颈是胰腺癌液体活检未来研究中需考虑的重要问题，后续仍需要大样本量的前瞻性研究，以严格评估液体活检在胰腺癌诊疗中的价值。

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