关于聚氯乙烯材质医疗器械细胞毒性可能风险点及检测方法的几点思考

伍锡栋 林引花

1 江西省医疗器械检测中心 （江西 南昌 330000）

2 南昌大学药学院 （江西 南昌 330000）

内容提要： 聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）因为性能稳定、价格低廉而广泛应用于医疗器械领域。PVC需要根据使用的需求不同而加入不同比例的增塑剂、热稳定剂、色素等添加剂，但是因为添加剂的使用会造成一定的生物毒性，对人体健康造成危害。在PVC材料加工时增塑剂和热稳定剂的使用量最大。文章主要分析PVC材质中增塑剂、热稳定剂的生物毒性，概述PVC材质医疗器械的生物安全性评价及检测方法，医疗器械的材质、状态、组成及添加物质均决定了生物毒性检测方法的选择，在实际检测过程中细胞毒性的检测应尽可能综合2种以上方法的结果进行评价。

聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）是由氯乙烯单体在过氧化物等引发剂或者光热条件下聚合而成的高分子聚合物。PVC是世界上最早实现工业化的合成树脂之一，在20世纪30年代初实现工业化，往后的30年里其产量一直居于世界塑料产量的榜首，直至60年代才被聚乙烯（Polyethylene，PE）超越，但产量仍占世界产量的四分之一以上。PVC具有加工方便、可消毒、柔软、耐压等优良特性，被广泛应用于日常生活。在医疗器械领域发挥巨大的使用价值。根据数据显示，2018年我国医用塑料市场消费中PVC的用量占比最大，高达28%[1]。PVC材质使用范围广，在医疗器械领域因为会与人体接触所以需要格外注意其生物安全性，需要对该类材质的医疗器械进行相关的生物学检测和评价。

细胞毒性试验是一种在体外借助相关的细胞，模拟细胞生长环境，具有广泛的通用性，在医疗器械的生物学评价中作为常规评价方法之一，是对医疗器械生物学评价的重要指标之一。该方法能在快速检测供试品或其浸提液对细胞的影响，能大批量筛选样品并快速反应毒性物质的敏感性。该方法具有易标准化、可操作性强、结果具有很强的实验室间比对性等特点，能为是否进行下一步生物学评价提供直接的参考依据。随着分子生物学和细胞生物学技术的快速发展，细胞毒性的检测方法也在不断发展，现行GB/T16886和ISO10993相关标准中可操作的试验方法主要包含浸提液试验、直接接触试验、琼脂扩散试验、滤膜扩散试验等。主要测试途径为：细胞形态的观察，细胞损伤的测定，细胞生长的测定和细胞代谢特性的测定。新生效版本紧跟国际ISO标准前沿，并保证了在方法学上与国际标准的近乎等同，让国内申报数据与产品注册更好地与国际接轨。

1.主要影响PVC材质医疗器械生物毒性的因素

1.1 增塑剂

PVC分子作为一种无定型高聚物，含有极性较大的C-Cl基团，分子间作用力强，在加工时需要添加增塑剂。增塑剂可以扩散进入PVC大分子之间并且与其聚合作用，通过削弱PVC分子间的范德华力，从而增加分子链的移动性，可以降低其玻璃化转变温度（Tg），提高PVC的可塑性[2]。但是PVC制品中的增塑剂会因为温度、PVC制品特性、增塑剂分子特性及含量等因素而向外界扩散，并且对人体存在潜在毒性[3]。使用最多的增塑剂是邻苯二甲酸类。在PVC材质医疗器械中DEHP（邻苯二甲酸二乙基己酯）作为最常使用的增塑剂之一，它对于人体的生殖系统和神经系统具有潜在毒性。李丹丹等[4]通过分析不同浓度的DEHP及其活性代谢产物MEHP对小鼠胚胎肝细胞的影响得出DEHP和MEHP对小鼠ESC活性都具有抑制作用，且存在浓度依赖性。李丹丹等[4]通过对妊娠大鼠连续DEHP灌胃染毒对子代大鼠神经行为的影响，发现DEHP及其代谢产物可能通过干扰神经类固醇CYP19A1芳香化酶基因的转录从而影响子代大鼠神经系统发育。韩佳萦等[5]通过不同浓度剂量的DEHP处理小鼠巨噬细胞株RAW164.7和腹腔巨噬细胞，发现DEHP抑制巨噬细胞分泌TNF- 、IL-12、IL-23等细胞因子，影响巨噬细胞的贴壁及吞噬能力，具有免疫抑制作用。

DEHP作为一种增塑剂被广泛应用于PVC产品中，现行使用的医疗器械产品应用PVC材料也非常普遍，其中最为关注的为输注类。文献报道高分子材料对药物存在不稳定性，原因是呈脂溶性的DEHP不以共价键结合于PVC分子上，易从塑料中溶出，而且其溶出物和量对人体的影响是近年来不断研究的对象[6]。DEHP的溶出量取决于温度、输注液体的脂溶性及与PVC材料塑料接触的持续时间等。DEHP的急性毒性轻微，有研究报道，实验动物通过多种途径（如经口或经局部注射）接受此化合物的半数致死量范围达到14～50g·kg，而静脉注射的半数致死量甚至高达200mg·kg[7]。在正常情况下，少量DEHP会在24h内经由尿液或粪便排出体外，但DEHP的主要代谢产物邻苯二甲酸单乙基己酯（MEHP）则会在人体组织中长期蓄积，生物蓄积时间可长达6个月甚至更久。DEHP的慢性毒性主要表现在对生殖系统、血液系统的影响以及肝脏毒性，由于PVC材质的医疗器械会通过化学作用等影响输出的药液性质和有效性等，更严重的甚至会影响人体的毒性反应和生命健康。从此种现象反应，医疗器械在生产过程中，增塑剂不可避免的使用使得PVC材质医疗器械必须受到国家政府机构的严格监管，如何减少增塑剂迁移或者开发环保型的可替代材料需要得到更多的关注。有文献报道，当胰岛素加入PVC袋装输液中时，1h即被吸附52.57%，到12h输出胰岛素浓度仅为开始时的36.89%，而在聚丙烯袋装输液时，输出的胰岛素浓度几乎保持不变[8]。医疗器械产业中PVC材质用于输液包材除了对某些药物有吸附损失以外，而且其添加的增塑剂等化学物质的溶出也会影响用药安全。聚丙烯是属于非PVC包材之一，对药物的吸附性小，且更加环保和安全，或许从医疗器械对药物吸附性方面考虑，聚丙烯更具有应用前景。

1.2 热稳定剂

PVC在加工温度>160˚C才能塑化成型，但是在加热过程中分子链增长会生成活泼的叔碳原子，叔碳原子与其相连的氯原子和氢原子很容易形成HCl并脱除。加入热稳定剂可以消除引起开始脱HCl的不稳定部位，并且迅速结合脱落下的HCl，从而抑制PVC的分解[9]。PVC中常见的热稳定剂有铅盐类、有机锡类、金属皂类。

铅盐类热稳定剂由于存在重金属铅，其迁移和在体内的累积必然会对人体的神经系统造成损害，造成智力和运动的异常，同时损伤骨髓造血系统引发贫血。含铅盐类热稳定剂的PVC材料也不适用于食品包装。有机锡类作为铅盐类的最常用替代品之一，安全性较为提高，但不是所有的有机锡类稳定剂是安全无毒的。国内常用的有机锡稳定剂为硫醇甲基锡。王伟等[10]根据国家标准使用硫醇甲基锡对SFP级小鼠进行急性经口毒性试验，得出硫醇甲基锡为中级毒性的结果。同时在硫醇甲基锡生产控制中容易生成高毒性的杂质TMT（三甲基氯化锡），根据朱海兵等[11]的病例分析可以知道TMT多造成人体中、重度中毒，导致患者头晕、精神行为异常和记忆力衰退。但是我国的有机锡稳定剂国家标准GB/T26026-2010《硫醇甲基锡》中并没有对TMT进行限量，缺乏对行业的标准限定，这对于生产人员和使用人员都存在一定的卫生风险。

金属皂类热稳定剂是复合型热稳定剂的主要成分，多为脂肪酸（月桂酸、硬脂酸等）的金属（钡、镉、锌、钙等）盐，这类热稳定剂除了与HCl作用外，还可以置换出活泼的烯丙基氯原子。近年来常见的金属皂类热稳定剂有复合钙锌热稳定剂，属于环保型材料。程建军等[12]通过流变实验和规模化生产对应用了钙锌热稳定剂的PVC材料考查，认为环保型钙锌热稳定剂可以替代有毒性的铅盐类热稳定剂。

2.常用的细胞毒性检测方法

2.1 直接接触试验

直接接触试验对材料的敏感性最高，可以检测出材料微弱的细胞毒性，适用于同时提取并测试从含血清培养基中提取到的化学物质。由于结果需要在显微镜下直接观察，所以操作过程中应避免不必要的移动，减少对细胞的物理损伤，避免假阳性的发生。个别产品不能单一依据此类方法的评价产品的细胞毒性，例如对于一些蛋白纤维类的材料在直接接触试验中没有出现细胞毒性，还需进行间接试验综合评价。Kuhbier等[13]对蜘蛛丝材料进行细胞毒性检测时发现蜘蛛丝材料进行直接接触试验时无细胞毒性，在间接接触试验中却有细胞毒性。所以仅凭直接接触试验的结果判断医疗器械的生物性能太过于片面，有时需要借助多种试验方法综合评价。

2.2 间接接触试验

间接接触试验是利用琼脂或者滤膜将样本和细胞分隔，观察样本中可通过中间介质的滤过性物质对细胞生长增殖以及细胞形态学的影响，适用于细胞毒性的定性评价，主要包括琼脂扩散法和滤膜扩散法两种试验方法。琼脂扩散法需要将含血清的培养基和融化的琼脂相混合，铺展在细胞表面并用中性红染液进行染色，中性红染色等琼脂凝胶化后将药品放置在琼脂上，观察样品褪色区域的大小来评定细胞毒性的等级。中性红是一种弱阳离子染料，通过进入到细胞内部溶酶体内，依赖于活细胞细胞膜的完整性进行显色，死细胞或无细胞不进行显色，所以可以根据显色区域的大小等来评价细胞活力[14]。而滤膜扩散法的不同点是将样品接种到滤膜上，将含细胞面朝下，放在凝胶化的琼脂上并将样品放在另外无细胞的一面，最后在培养24h后，采用琥珀酸脱氢酶等进行染色处理，观察褪色区域大小，结合相关的评价标准进行细胞毒性分级。

2.3 浸提液试验

浸提液试验主要为MTT比色法，原理是属于水溶性四氮唑染料的MTT在活细胞还原为紫色非水溶性甲瓒，用DMSO溶解后可以通过酶标仪定量甲瓒，通过对比试验组和对照组的吸光度来评估样品细胞毒性。MTT比色法灵敏度高，可用于细胞毒性的定量分析，但是重复性稍差[15]。该方法是按照GB/T 16886.12和ISO10993.12相关标准中相关方法对受试材料进行浸提液制备，在特定的温度、湿度和转速的摇床中浸提一定时间后，用浸提液直接与一定浓度的细胞作用一定的时间。对受试材料溶出物的毒性检测敏感性较高，与动物体内毒性结果的真实性比较吻合。该方法可检测可溶于浸提介质的可溶出物的细胞毒性反应，对于不溶于浸提介质的溶出物的细胞毒性评价不适用。胡煜雯等[16]对新版GB/T16886.5-2017中的MTT比色法进行解读，认为MTT法存在假阴性的可能，并且提出XTT和CCK8这两种试验方法也值得利用不同材料的医疗器械进行交叉对比。进行对于同一种样品，选择的检测标准不同其结果会有所不同。严小莉等[17]采用直接接触试验和MTT比色法对液体创可贴进行细胞毒性检测，发现直接接触试验的细胞无法增殖而MTT比色法的细胞可正常贴壁生长。孙皎[18]提出生物学评价试验本身因现有技术水平有限无法达到准确无误的预测结果，且医疗器械的生物学评价应根据器械的实际应用情况设计相对的试验。

近年来RCTA法（实时无标记细胞分析法）被提出可以适用于医疗器械的细胞毒性检测，但还未纳入国家标准中。王海涛等[19]针对RACT法的线性范围、精密度和重复性等在8种医疗器械产品中进行考察，同时与MTT比色法的结果进行对比，发现RCTA法快捷简便，结果准确可靠，可以初步适用于医疗器械体外细胞毒性评价。黄婷等[20]对56批次的医疗器械检品进行RCTA法和MTT法结果对比，发现RCTA法可以有效检测医疗器械细胞毒性，但是不适用于部分有溶出物干扰检测的检品。

3.讨论

直接接触法、琼脂糖扩散法、MEM洗脱法（形态观察法）以及MTT法等。鉴于化合物或者医疗器械一般仅选用其中一种检测方法用于法规申报或者毒性研究，因此对细胞毒性检测方法的选用至关重要。现根据上述方法的概述比较分析各种方法的不同，其中，直接接触法中需将供试品制成规定的形状，将供试品直接放置于细胞层，能较为直接的评估到供试品对细胞层的毒性影响，此法对供试品要求较为严苛，密度过大或者过小都将影响试验的操作和评估，操作时需注意防止不必要的移动，否则会导致细胞的物理性损伤。相比于直接接触法，琼脂扩散法通过在细胞层上附加一层琼脂或者琼脂糖，克服了直接接触法易导致物理性损伤的缺点，但该试验不适用于不能通过琼脂层扩散或可能与琼脂相互作用的可沥滤物，使用琼脂糖试验进行细胞毒性评定应进行论证。MEM洗脱试验为美国药典推荐试验，使用供试品浸提液/溶液给药，等同于该标准下的形态观察法，通过显微镜观察评价细胞的圆缩比例、贴壁是否疏松、胞浆内有无颗粒、有无大范围细胞溶解、细胞生长是否抑制等综合评价细胞毒性，毒性评价为评分0～4级5个等级来客观评价细胞毒性的反应在程度，较原标准多了个1个等级，且更为详细和标准化，浸提液试验作为现行细胞毒性检测最常用的方法，但由于在GB/T 16886.12和ISO10993.12等标准对样品的浸提液制备方法只规定了固体类材料，对于液体类的样品没有进行明确的规定，导致一些液体类产品浸提液制备方法的不适用性套用，直接影响对此类产品细胞毒性的客观评价结果，因此该法的主观评分对技术员的观察经验和积累有更高的要求。相对于MEM洗脱试验，MTT细胞毒性试验更为客观。MTT细胞毒性试验为国内较为广泛的细胞毒性检测方法，黄色水溶液MTT在活细胞内代谢性还原，生成蓝紫色不可溶的甲臜。活细胞的数目与甲臜溶于醇类后用光度计测定的色度相关。

增塑剂可以增强塑料制品的柔韧性和断裂拉伸率，改善PVC产品的成型加工。热稳定剂吸收HCl，置换出高分子链中的活泼原子，捕获自由基，抑制PVC制品的老化降解。PVC材料在加工时加入增塑剂和热稳定剂是必不可免的工序，但是这两种添加剂中绝大部分的化学助剂存在一定的生物毒性。开发环保型的化学助剂，减少PVC材质对人体以及环境的危害，是目前化学助剂行业最重要的问题。

由此可见，各类型细胞毒性检测试验的原理与方法各不相同，而各方法中又有很多影响检测结果的参数，根据试验材料本身的理化性质、毒性作用强弱及其用途正确的选择试验方法及相关参数十分重要，生物学评价试验的现行标准不完善，生物学评价试验的方法和评判依据主要参照现行的相关标准文件，而标准推荐的方法并非一定代表当今生物学和医学领域中最先进、最有效和最适合的检测手段。PVC材质医疗器械领域的使用，受到国家的严格管控，但是按照国家统一规定的GB/T16886.5-2017标准对医疗器械进行相应的细胞毒性检测，结果会有所差异，如果要得出正确的评判，需要研究者不断地尝试和探索。改善国家标准中的检测方法，抑或是寻找更加适用的检测新手段，提高检测的准确度和可靠性。对有关医疗器械的检测，需要检测人员根据医疗器械产品的特性，探寻出合理有效地检测方法，以期达到有效地评价医疗器械产品细胞毒性的目的。