稀土配合物分子印迹荧光探针的制备及检测孔雀石绿的残留

邵可满，傅桂瑜，陈素艳，洪诚毅，林郑忠，黄志勇

集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021

引 言

孔雀石绿(MG)是一种有效的水产养殖杀菌剂和寄生性杀菌剂[1]，作为治疗真菌和原虫感染的药物，能起到驱虫杀菌，延长鱼类的存活时间的作用，在水产养殖业得到广泛应用[2]。研究发现MG具有高残留、高毒性，会产生致畸、致癌、致突变等“三致效应”[3]。但由于MG价格低廉且杀菌效果好，仍然有不少商家违法添加使用，近年来发生了多起MG残留的食品安全事件，因此MG的日常检测是非常有必要的。

目前常用于MG检测的方法主要有高效液相色谱法[4]、液相色谱-质谱联用(LC-MS)[5]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)[6]、以及表面增强拉曼光谱法(SERS)[7]。虽然这几种检测方法灵敏度高、选择性好，但样品前处理复杂、操作繁琐、仪器昂贵等缺点限制了这些方法的使用。因此寻找一种快速高效的MG检测方法仍有十分重要的意义。

分子印迹聚合物(MIPs)是一种多孔隙材料，有特定的识别位点，对特定的目标分子具有较强的识别功能[8]。由于其制备简单，具有良好的化学性能、机械性能，在食品分析，化学传感器和固相萃取等方面广受人们的关注[9]。沉淀聚合法属于非匀相溶液聚合，聚合物不溶于溶剂中，聚合物自发地从溶剂中沉淀出来，得到的聚合物微球粒径小，形态均匀，不需要经过研磨、过筛等特殊处理，可避免印迹位点的丢失，操作简便。

以硅烷偶联剂(KH570)改性的二氧化硅为核，Eu(MAA)3Phen为荧光物质，隐形孔雀石绿(LMG)为模板，丙烯酰胺(AM)为功能单体，双甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)为交联剂，2,2’-二偶氮异丁腈(AIBN)为引发剂，乙腈为溶剂，采用沉淀聚合法制备了MIP荧光微球。这也是国内外首次用稀土配合物为荧光源制备MIP的研究报道。采用FTIR、荧光寿命等对荧光探针进行了表征；考察了MIP和NIP的荧光性能、吸附性能、选择特异性；考察了MIP与MG浓度的线性关系；将制备的MIP用于水产品中MG的加标回收测定实验中。结果表明，制备的荧光探针具有灵敏度高、特异性强的优点，能实现对MG的快速检测。

1 实验部分

1.1 试剂

甲基丙烯酸(MAA)、邻菲罗啉(Phen)、氯霉素(CAP)、四环素(TC)、隐性结晶紫(LCV)、结晶紫(CV)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺噻唑(ST)、金氯素(CTC)、萘啶酸(NA)、隐色孔雀石绿(LMG)、乙二醇二甲基丙烯酸均购于(上海阿拉丁生化科技有限公司)；氧化铕、磺胺胍(SG)、磺胺嘧啶(SD)均购于(上海麦克林生化科技有限公司)；孔雀石绿、偶氮二异丁腈购于(国药集团化学试剂有限公司)。丙烯酰胺购于(西陇化工有限公司)。试剂均为分析纯。

1.2 仪器

瞬态/稳态荧光光谱仪(英国Horiba公司,FLS-980)；紫外-可见分光光度计(美国PerkinElmer公司,Lambda265)荧光分光光度计(美国PerkinElmer公司,LS55)；红外光谱仪(美国ThermoFisherScientific,NicoletiS10)；磁力搅拌器(大龙兴创实验仪器有限公司MS-H-Pro)；透射电子显微镜(日本电子株式会社,JEM-2100)；垂直旋转混合仪(杭州米欧仪器有限公司,VM-80)。

1.3 稀土荧光配合物Eu(MAA)3Phen的制备

稀土荧光配合物的制备参考文献[10]的做法并加以改进:往0.35 g Eu2O3中加入20 mL浓盐酸，加热至出现晶膜，加入20 mL无水乙醇溶解，得到EuCl3无水乙醇溶液。在三口烧瓶中加入510 μL MAA、0.36 g Phen、20 mL无水乙醇，并用25%～28%氨水调节pH值约为7。搅拌下将EuCl3无水乙醇逐滴加入，升温至60 ℃持续搅拌反应4 h，静置、抽滤后用乙醇洗涤沉淀数次，于50 ℃真空干燥8 h，得到白色固体粉末Eu(MAA)3Phen。

1.4 MIP@SiO2@Eu(MAA)3Phen的制备

往100 mL圆底烧瓶中加入5 mL乙腈，0.125 mmol LMG和0.75 mmol AM，超声分散均匀后放置在4 ℃冰箱中预聚合2 h。随后往上述溶液中加入15 mg稀土配合物，KH570处理过的SiO2微球60 mg，AIBN 50 mg和1.25 mmol交联剂EGDMA，超声30 s混合均匀后通入N220 min以除去溶液中的氧气，随后加入50 mg AIBN。在60 ℃水浴下磁力搅拌(1 000 r·min-1)反应30 min，后将转速调至800 r·min-1反应5.5 h。反应结束后抽滤得到粗聚合物，将其置于乙醇∶乙腈=7∶3 (V∶V)混合液中索氏抽提，直至紫外分光光度计下无LMG检出，得到聚合物MIP，将MIP干燥后备用。不加入模板的分子印迹聚合物(NIP)的合成过程除不加LMG外，其余步骤与MIP的制备一致。

1.5 荧光测试

往离心管中加入浓度为0.02 mg·L-1的配合物溶液2 000 μL，分别用含有MG的乙腈溶液和纯乙腈定容到2 050 μL。控制狭缝为10 nm，在激发波长为270 nm下测定发射波长618 nm处的荧光强度，计算猝灭效率F0/F，F0为未添加MG时溶液的荧光强度，F为添加了MG后溶液的荧光强度。

1.6 加标回收实验

将5 g剁碎的鱼肉加入质量分数为20%的盐酸羟胺1.5 mL和0.05 mmol·L-1的乙酸铵溶液3.5 mL，匀浆5 min后，取1 g匀浆液，加入MG乙腈标准溶液，用2 mL乙腈超声提取5 min，于1 000 r·min-1离心5 min，收集提取液，重复2次，合并两次提取液，将提取液用N2吹干，吹干后，用6 mL乙腈复溶，加入MIP，混匀于室温下静置20 min后，在270 nm激发波长下测定溶液的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 TEM

利用TEM表征了MIP，NIP和SiO2的结构和形态。由图1可知:MIP，NIP和SiO2均呈球状结构，从图1(c)中可以看出SiO2粒径较小，以SiO2为核，采用沉淀聚合法合成MG的分子印迹聚合物，由图1(a)和(b)可以看出，MIP和NIP的粒径明显比SiO2的粒径大，可以说明稀土配合物Eu(MAA)3Phen已负载在SiO2的表面。

图1 MIP(a),NIP(b)和SiO2(c)的透射电镜图Fig.1 TEM images of MIP(a),NIP(b)and SiO2(c)

2.2 红外光谱分析

图2 MIP和NIP的红外光谱图Fig.2 FTIR spectra of MIP and NIP

2.3 荧光寿命

荧光寿命的测量在FL980-STM稳态/瞬态荧光光谱仪上进行。测量加入10 μmol·L-1MG前后MIP的荧光寿命图谱，按照式(1)进行数据拟合。

(1)

式(1)中，A为背景，R(t)是对应时间的MIP的荧光强度；τ1和τ2分别为MIP辐射和非辐射寿命。B1和B2是对应的统计权重。平均荧光寿命(τav)根据式(2)计算。

(2)

式(2)中，τi是测量的寿命，Bi是统计权重的数值。

荧光寿命试验结果如图3所示，MIP的荧光寿命为1 094.11 μs，而加入MG后荧光寿命为587.49 μs。荧光寿命减少说明MG对MIP的猝灭属于荧光共振能量转移FRET[13]。这是因为MIP的荧光峰与MG的吸收峰重叠，且两者以均相形式存在，荧光给体和受体的距离很短，因此可以发生显著的FRET效应。

图3 加入MG前后MIP的荧光寿命图谱Fig.3 Fluorescence lifetime mapping of MIPs before and after the addition of MG

2.4 选择性

按照1.5的实验方法，考察在2.5 μmol·L-1的SG，SD，SDM，CAP，TC，LCV，CV，CTC和NA乙腈溶液和MG乙腈溶液对MIP和NIP的荧光猝灭程度，结果如图4所示。

图4 不同药物对MIP和NIP的猝灭效率 (浓度为2.5 μmol·L-1)Fig.4 Quenching efficiency of MIP and NIP by different drugs (at a concentration of 2.5 μmol·L-1)

虽然这几种物质也能对荧光探针的荧光造成猝灭，但猝灭程度均低于MG，这是由于这些物质的吸收波长与荧光探针的吸收峰的位置(618 nm)有不同程度的重叠，也能发生不同程度的荧光共振能量转移，特别是CV的重叠程度较大。由于NIP不存在印迹位点，CV和MG的猝灭程度相差不大，MG及其类似物的荧光均会下降；而在MIP中，CV的猝灭程度则小于MG，这是由于在MIP中存在能够与MG特异性结合的印迹位点。

2.5 荧光响应时间

在MIP和NIP中分别加入2.5 μmol·L-1MG-乙腈溶液，考察其在不同反应时间下的荧光强度，同时以不加MG作为对照。由图5可以看出，在不加入MG时，MIP和NIP的荧光强度保持相对稳定，加2.5 μmol·L-1MG后，MIP和NIP的荧光强度在短时间内迅速降低，并且在20 min后趋于稳定。因此，实验中选择加入样品20 min后再测量荧光值。

图5 MIP和NIP的动力学曲线Fig.5 Kinetic curves of MIPs and Nips

2.6 MG标准曲线

分别测定加入MG浓度为0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1，3，5，7，9，10，15和20 μmol·L-1时MIP的荧光强度，结果如图6所示。可以看出，MIP在与MG发生荧光猝灭之后，荧光探针的发射峰波长位置没有发生变化，说明荧光探针与MG之间是非辐射能量转移[14]。MG与荧光探针之间的荧光猝灭符合Stern-Volmer方程[15]，F0/F=1+KSV[c]。其中，F0表示无MG时聚合物的荧光强度；F表示加入MG后聚合物的荧光强度；KSV为猝灭效率；c为MG的浓度。

图6 MIP对MG荧光猝灭程度(插图为MIP加入MG前后在365 nm紫外灯下的荧光图

在优化条件下，向聚合物乙腈溶液中加入不同浓度的MG乙腈溶液，20 min后分别测定加入MG前后的探针荧光强度，荧光光谱如图6所示。以猝灭效率(F0/F)和MG浓度建立标准曲线，F0/F与MG浓度呈现良好的线性关系(图7)，在低浓度下线性方程为F0/F=1.008c+0.344(0.1～1 μmol·L-1,R2=0.991)；在高浓度下线性方程为F0/F=0.587c+0.570 (1～20 μmol·L-1，R2=0.999)。检出限为0.037 μmol·L-1(3σ/S，n=9)，因此实验中所制备的聚合物MIP可用于实际样品中MG的快速检测。

图7 F0/F与MG浓度线性关系Fig.7 Linear relationship between F0/F and MG concentration

2.7 加标回收实验

将MIP用于鱼肉样品中进行加标回收实验，实验中MG加标浓度为1，5和10 μmol·L-1，回收率结果如表1所示。可以看出，本方法对鱼肉中MG的加标回收率在95.61%～102.51%之间，相对偏差低于5.21%。

表1 不同方法检测鱼肉样品中MG的回收率Table 1 Recovery of malachite green from fish meat samples detected by different methods

为了验证方法的准确性，利用国标方法[16]对鱼肉样品进行加标检测，回收率结果如表1所示。可以看出两种检测法的检测结果相当，国标方法的加标回收率在89.35%～113.51%之间，相对偏差低于6.17%。本方法的加标回收率说明了本方法检测鱼样中MG残留具有快速、准确、方便的优势。

3 结 论

采用沉淀聚合法，以稀土荧光配合物为荧光光源，制备了一种孔雀石绿分子印迹聚合物，该聚合物荧光发射峰在618 nm，与MG的最大吸收波长匹配，两者之间可以发生FRET效应，因此配合物的荧光能被MG猝灭。聚合物对MG的线性范围为0～20 μmol·L-1，线性方程为F0/F=1.008c+0.344 (0.1～1 μmol·L-1,R2=0.991)；F0/F=0.587c+0.570(1～20 μmol·L-1，R2=0.999)，检出限为0.037 μmol·L-1。将其作为荧光探针应用于鱼肉中MG的检测，加标回收率在95.61%～102.51%范围内，本文创新性地以LMG为替代模板用于MG的检测、首次以稀土配合物为荧光制备MG-MIP，使荧光探针对MG的检测灵敏度进一步提高。