梨黑斑病拮抗菌的筛选研究

侯晓杰 于占晶 梁魁景

（衡水学院生命科学学院 河北 衡水 071000）

梨黑斑病在我国普遍发生，其中以雪花梨和酥梨发病最为严重。该病主要是由真菌性链格孢菌(Alternaria alternate(Fr.)Keissl)感染所引起[1]。梨树的开花期和幼果期都是梨黑斑病的潜在感染期，尤其是在贮藏期间最易感病，不易控制和预防[2]。这对我国梨产业和出口商造成了严重的威胁[3]。

目前，我国生产上防治梨黑斑病主要是使用化学防治方法和物理防治方法。化学防治易造成生态失衡，提高某些病虫害对药剂的抵抗力，降低防治效果，危害人畜健康，给生态环境造成严重污染[4，5]。物理防治环境安全性高，但是效率低，不易彻底清除病菌，防治效果十分有限，因此迫切需要找到一种防治梨黑斑病的新技术。

生物防治[6]是近年来备受推崇的一种预防病虫害的新型防治方法，其特点是不会对环境造成污染，安全高效，经济实惠，同时不会使病虫害产生抗药性，促进了农业的可持续发展。植物内生菌是一种能在植物体内生存的微生物，可以与植物互利互生[7]。目前，我国已经有关于植物内生菌对梨黑斑病菌的抑制作用的研究，如吴慧昊[7]等在花椒提取物对苹果梨采后黑斑病的抑制的研究中发现，花椒提取物对梨黑斑病菌有直接的抑制作用。高小宽[8]等在三七提取物对储藏期梨黑斑病的防治研究中发现，三七提取物可以明显抑制梨黑斑病在果园的扩大，降低了梨黑斑病菌对果实的侵染。龙飞[9]、梁魁景[10]等研究了姜提取物对储藏期梨黑斑病病菌孢子和菌丝的抑制作用，发现姜提取物对梨黑斑病菌也有较好的防治效果。我国地大物博，生物资源丰富，最适合研究植物源农药[11]，开发植物源农药市场前景十分可观，现已成当下研究的热点[12]。

1 材料与方法

1.1 试验材料。细菌(P2、ZJ01、J4、J5、J6、T4和T7)、真菌(梨黑斑病菌)均由衡水学院园林植物学实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 梨黑斑病菌的活化。于灭菌超净工作台上，挑取4℃低温下试管内保存的梨黑斑病菌接种至事先制备的PDA平板上，置于28℃恒温生化培养箱中培养4～5 d，观察病原菌的生长情况并备用。

1.2.2 细菌的活化培养。采用平板划线法。将-28℃冰箱甘油中保存的7种细菌(J4、J5、J6、T4、T7、P2、ZJ01)采用“之”字划线法接种在NA平板上，倒置于28℃的恒温培养箱中培养2 d备用。

1.2.3 梨黑斑病菌菌丝生长抑制试验。采用对峙培养法。于超净工作台上，用0.6 cm打孔器打取梨黑斑病菌边缘制作菌饼，将其倒置接种至PDA平板中央；在距菌饼中心3 cm处，左右分别画线接种测试拮抗菌株，每处理设3个重复，同时设置空白对照。28℃恒温下培养4～5 d，观察菌落生长情况。用十字交叉法测量病菌菌落生长直径。

1.2.4 梨黑斑病菌孢子萌发抑制试验。孢子悬浮液的制备：梨黑斑病菌置于28℃恒温箱内培养10 d左右，使其产生大量孢子。超净工作台上，利用接种环刮取平板表面孢子到无菌水三角瓶中，用4层滤纸过滤，密封，充分震荡三角瓶使孢子悬液混匀。在显微镜下观察孢子个数，使其稀释成每视野50个左右的孢子的悬浮液，备用。采用抑菌圈法测定孢子萌发抑制情况。取100μl病菌孢子悬浮液置于PDA平板上，用玻璃刮环将其涂抹均匀，超净工作上晾干备用，用10mm打孔器在细菌培养平板上打孔，再用接种铲将其倒扣接种到PDA平板中央。放置于28℃恒温生化培养箱中培养，后用十字交叉法测定细菌对孢子萌发的抑制情况。孢子萌发抑制率(%)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100%。

1.3 数据处理与分析。应用Excel软件来进行试验数据的统计，采用SPSS 16.0软件对统计数据进行分析，分析不同细菌菌株对梨黑斑病菌抑制效果的差异性，显著性水平为5%(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 7种细菌对梨黑斑病菌菌丝生长速率的影响。如图1所示，48 h后连续5 d测量病原菌菌落直径，结果发现，7种细菌对梨黑斑病菌菌丝均有一定的抑制作用。根据图1判断，从第3 d开始，7种细菌对梨黑斑病菌菌丝生长均有抑制作用，且随着时间的推移，抑制作用越来越明显。对7种菌株进行分析可知，P2抑制效果最好，其次为T7、T4，J4、J6和ZJ01抑制效果较差。对同一菌株分析不同时刻的数据可知，即使在抑菌效果较好的细菌平板上，病原菌菌落直径仍表现出增长的发展趋势，拮抗细菌并未完全抑制病菌的生长，所以推断，拮抗细菌的使用时间以提早为好。

图1 7种细菌对梨黑斑病菌菌丝生长速率的影响

2.2 7种细菌对梨黑斑病菌孢子萌发的抑制作用。试验中抑菌圈直径越小，抑菌率越高，说明细菌对其的抑制效果越好，各细菌的抑菌效果见表1。由表1中7种细菌在同一浓度下对梨黑斑病菌丝生长的抑制研究可知，T7菌株对梨黑斑病病菌孢子萌发的抑制效果明显，梨黑斑病菌菌落的平均直径为39 mm，抑菌率为48.92%；其次是P2与J5，抑制率分别为46.23%和45.03%，二者无显著差异；ZJ01、T4和J6抑菌效果无明显差异，抑菌效果中等，抑菌率分别为44.86%、44.83%和44.06%三者差异不显著；抑制效果最差的是J4，平均抑制率仅为38.26%。

表1 7种细菌对梨黑斑病菌的抑制作用

3 结论与讨论

本次试验采用J4、J5、J6、T4、T7、P2、ZJ01等7种细菌进行梨黑斑病拮抗菌筛选研究，试验结果显示，T7对梨黑斑病菌落生长抑制效果最好，抑制率高达48.92%，且与其他细菌的拮抗效果有显著性差异。本次试验仅仅选用了7种细菌作为研究材料，但我国资源丰富，希望此次试验数据可以为以后梨黑斑病防治提供一定的理论基础。本次试验研究的细菌对梨黑斑病菌都有一定的抑制效果，其中T7是从苹果树根际土壤中分离到的细菌，大多数根际微生物产生的多种抗菌类和酶类，抗菌效果均较好，对植物和人没有危害。此次试验为进一步研究生物制剂防治梨黑斑病菌奠定了一定基础。