脂肪酸转位酶在肺动脉内皮细胞中的作用研究*

沈 芹，徐宁，黄晋博，倪松石

(南通大学附属医院呼吸与危重症医学科，南通 226001)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)，定义为右心导管测量肺动脉压平均≥25 mmHg，同时肺小动脉楔压≤15 mmHg 及肺血管阻力＞3 Wood单位，是多种复杂因素导致的血流动力学障碍性疾病[1]。未经治疗的PAH 会持续进展，出现慢性肺源性心脏病，右心代偿性肥厚和右心衰竭[2]。尽管在潜在治疗靶点和引入新药的知识方面取得了进展，但5年生存率仍然很低[3]。近年来，探讨PAH 发病机制的主要研究集中在代谢途径的差异调控上。脂肪酸转位酶(fatty acid translocase,FAT/CD36)属于一种糖蛋白，主要存在于细胞表面，能与大多数脂肪酸发生特异性结合[4]。多项研究[5-7]表明，CD36 介导的脂肪酸代谢在口腔癌、宫颈癌、胃癌等肿瘤细胞的增殖和转移中具有重要作用。CD36 缺乏可降低人类和小鼠心脏、骨骼肌和脂肪组织对脂肪酸的吸收[8]。因此，推测CD36 可通过脂肪酸代谢途径影响PAH 的发生发展。本文通过探究CD36 对人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAEC)的作用及其机制，探讨CD36 及其下游通路对PAH 的作用，为其可能的靶点提供理论依据，为PAH 的治疗奠定良好的基础。

1 材料和方法

1.1 资料收集 纳入标准：本研究收集2021 年1月—2022 年1 月在南通大学附属医院确诊为PAH的患者20 例，其中男8 例，女12 例，年龄30～65 岁，诊断标准按照2021 年中华医学会呼吸病学分会肺栓塞与肺血管病学组的《中国肺动脉高压诊断与治疗指南》，根据住院患者心脏彩色多普勒超声的检查结果分为轻度PAH：31～＜50 mmHg，中度：50～＜70 mmHg，重度：≥70 mmHg。正常人样本由20 名健康成年志愿者捐献。排除标准：患有慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、急慢性心功能不全、动脉栓塞、脑血管意外、急慢性肝炎、间质性肺病等疾病的患者，依从性差的患者。血液样本均自肘静脉抽取，置于枸橼酸钠抗凝管中。本研究均经南通大学附属医院伦理委员会批准(伦理号：2020-L088)，研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 CD36 抗体、β-actin 抗体(美国CST)，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)引物(南通翱翔生物)，胎牛血清、DMEM 高糖培养基(Gibco,美国)，Lipofectamine 2000 转染试剂(Thermo Fisher，美国)，细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK8)(BiosharP 生物)，凋亡试剂盒(南京福麦斯生物)，CD36 过表达病毒、CD36 干扰病毒(上海吉凯基因)。

1.3 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 收集血清样本，测试前未予药物治疗，早晨空腹时间收集血液，室温静置1 h，3 000 r/min 离心20 min，收集上层液体至清洁EP 管，加入Biotin-Conjugated Antibody，酶标仪读取450 nm 处吸光度。根据标准曲线使用Excel 计算得出CD36 质量浓度。

1.4 HPAEC 培养和转染 HPAEC 细胞株购自中国科学院细胞资源库。HPAEC 细胞培养于含10%胎牛血清的细胞培养基中，置入恒温细胞培养箱(37 ℃，5%CO2)中培养，待细胞完全贴壁后(48～72 h)换液。取对数生长期的2×104个HPAECs 细胞接种在24孔细胞培养板上，分别加入对应的病毒，并添加适当的病毒感染试剂，转染6 h 后换液培养。

1.5 CCK8 增殖实验 消化细胞，调整细胞密度，使每孔约2 000 个细胞，按100 μL/孔的标准把细胞悬液转移至96 孔板内。及时吹打细胞悬液，使细胞充分混匀。96 孔板最外侧一圈加基础培养基；共设置对照组、CD36 敲减组、CD36 过表达组，并设置多个复孔，共设置4 块96 孔板。观察细胞状态，分别于贴壁0、24、48、72 和96 h 把CCK8 添加至细胞内，在450 nm 处对每孔吸光度进行检测，测定各孔的吸光度(optical density,OD)值。时间为横坐标，OD 值为纵坐标绘制曲线。

1.6 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR) 细胞转染后24、48 h，收集细胞并提取核酸，进行qRT-PCR 分析。以上实验重复3 次，对其平均值进行计算。

1.7 Western Blot 分析 收集细胞，提取细胞蛋白，定量蛋白浓度，进行Western Blot 检测，抗体为抗βactin 抗体、抗CD36 抗体，曝光后进行灰度扫描，记录目的蛋白相对表达量。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞重悬，约100 μL，加10 μL 20 μg/mL 的碘化丙啶溶液和5 μL Annexin V/AlexaFluor 647，混匀后于室温孵育15 min(严格避光)。在反应管中加适量磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)(根据具体细胞密度调整，细胞密度大，则PBS 量多；细胞密度低，则PBS量少)，流式细胞仪分析。

2 结果

2.1 血清中CD36 质量浓度 正常人及PAH 患者的血清中CD36 质量浓度分别为(20.01±1.01) pg/μL、(14.62±0.82) pg/μL，PAH 患者血清中CD36 质量浓度显著低于正常人(P＜0.05)。

2.2 构建稳定敲减及过表达CD36 的HPAEC

2.2.1 转染效率 转染3 d 后，使用显微镜查看细胞状态，根据绿色荧光的多少及强弱初步判断转染效率的高低，结果可见病毒转染细胞率达90%以上(图1)。

图1 转染3 d 后HPAEC 的荧光表达情况

2.2.2 转染后HPAEC 中CD36 蛋白及mRNA的表达情况 Western Blot 检测各组CD36 的蛋白表达水平，敲减组CD36 蛋白表达降低，过表达组CD36 蛋白表达升高，提示细胞株转染成功(图2A～B)；转染CD36 敲减慢病毒的细胞株中，CD36 mRNA 表达量较对照组显著降低；转染CD36 过表达慢病毒的细胞株中，CD36 mRNA 表达量较对照组显著增高(图2C)。

图2 各组转染后CD36 的蛋白及mRNA 表达水平变化

2.3 CD36 敲减和过表达对细胞凋亡和增殖的影响流式细胞术发现CD36 敲减组中的细胞凋亡率显著低于对照组(P＜0.05)，而CD36 过表达组凋亡率显著增加，提示过表达CD36 对HPAEC 有一定的促凋亡作用(图3A～B)。CCK8 法结果显示过表达CD36 组HPAEC 细胞增殖速度较对照组显著减慢(图3C)，提示CD36 过表达抑制了HPAEC 的增殖。

图3 CD36 敲减和过表达CD36 对HPAEC 细胞凋亡和增殖的影响

3 讨 论

PAH 患者的临床表现差异较大，通常早期无特异性症状，仅在活动后出现胸闷、气短等症状。因PAH 症状缺乏特异性，其诊断较为困难，很多患者诊断时已出现右心功能不全。右心导管检查是诊断PAH 的金标准，但为有创检查，有并发症甚至死亡的风险，需送往有经验的PAH 诊疗中心，进一步增加了PAH 的诊断困难[9]。而现在临床针对PAH 应用的药物大多是延缓血管重构和右心功能不全，很难从根本上治愈PAH。因此寻找新的生物标志物与治疗靶点，对于PAH 的诊断和治疗显得尤为重要。

越来越多的证据[10]表明，脂肪酸氧化和氨基酸分解的代谢变化与PAH 的形成有关。新出现的证据指向PAH 的代谢理论，表明PAH 是由抑制线粒体呼吸和葡萄糖氧化(称为癌症代谢中的Warburg 效应)引起的。它使细胞迅速增殖而不经历细胞凋亡，并加速PAH 中的血管重塑[11-12]。在Warburg 效应期间的各种代谢变化对于PAH 的发生和维持也是必不可少的[12-13]。此外，涉及脂肪酸氧化和氨基酸分解的代谢变化也被认为与PAH 的形成有关[14]。对这些途径的更深入理解有可能为PAH 的诊断和治疗提供靶点。

本研究提供了对PAH 代谢特征的见解，有可能揭示新的生物标志物和治疗靶点。在本研究中，参与脂肪酸和葡萄糖代谢的重要分子CD36，在PAH 患者血清中表达水平显著降低，表明CD36 有可能通过脂肪酸代谢途径参与PAH 的发展过程。为进一步探索CD36 在PAH 发生发展中的作用机制，通过构建敲减及过表达CD36 的HPAEC，发现CD36 敲减组HPAEC 凋亡率显著下降，而CD36 过表达组HPAEC凋亡率显著增加，细胞增殖能力显著降低。

综上所述，代谢异常与PAH 的形成密切相关，而CD36 影响PAH 形成的具体机制有待进一步研究。