绵羊源大肠杆菌的分离以及对β-内酰胺类药物的耐药性分析

依再提古丽·热依木江 狄汶洁 马雪， 张丽媛， 李劼 周霞* 黄新 吴桐忠 韩猛立 张星星 钟发刚

1.石河子大学动物科技学院 832003

2.新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室 832000

大肠埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli）是导致人和动物感染及全球食源性疾病暴发的主要原因。目前，在临床中绵羊感染大肠杆菌主要应用抗生素控制和治疗。同时抗生素的普遍使用，使得E.coli耐药菌株不断产生，治疗效果不佳。研究表明，来自健康动物的E.coli也表现出不同程度的耐药特性。而且动物体内正常菌群E.coli可通过自身基因突变或捕获外源基因获得新的耐药性，此外耐药基因还能水平转移和垂直传播，成为动物体内潜在的耐药基因库。基于β-内酰胺类抗生素在兽医临床中的长期广泛应用，绵羊消化道E.coli是否存在β-内酰胺类耐药表型以及携带β-内酰胺类某些耐药基因值得研究。因此本研究在分离绵羊肠道正常菌群大肠杆菌基础上，测定分离株对绵羊源β-内酰胺类抗生素耐药表型和基因的携带情况，为后期羊源致病性E.coli耐药性的研究提供有意义的数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粪便来源于2019 年5 月无菌采集石河子地区部分羊场阿勒泰羊、新疆细毛羊、哈萨克健康羊粪便。

1.1.2 主要试剂和培养基E.coli质控菌株ATCC25922 购自中国兽药监察所。Mix Taq 酶、dNTP、10×PCR buffer、DL2 000 DNA Marker 等均为TaKaRa 公司产品。其他培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.3 引物的设计与合成β-内酰胺类耐药基因引物和细菌16S rRNA 通用引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，引物情况见表1。耐药基因包括SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、TEM、CTX-M -9。

表1 大肠杆菌16S rRNA 通用引物、β-内酰胺类耐药基因所用引物

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离及生化鉴定将绵羊粪便样品稀释采用无菌棉签均匀地涂布于普通琼脂平板，放置恒温箱经过37℃，18h～24h 培养后，观察细菌菌落生长特点，将细菌纯化后涂片、革兰染色、镜检。将可疑菌接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、VP、MR、吲哚试管中，37℃培养2～3d 观察结果。

1.2.2 细菌16S rRNA 序列分析以细菌基因组DNA 提取试剂盒提取的DNA 为模板对目的基因进行扩增。PCR 反应体系20μL。条件：95℃ 5min 预变性，94℃ 50s 变性，56.5℃退火30s，72℃延伸90s，30 个循环，72℃延伸10min。扩增产物送至公司（北京睿博兴科生物技术有限）进行测序。

1.2.3 耐药表型检测依据K-B 纸片法和美国临床试验实验室标准化协会手册进行药物敏感性表型测定，以ATCC25922 质量控制菌，检测100 株绵羊源E.coli对β-内酰胺类药物的耐药表型检测。检测的抗生素包括青霉素、阿莫西林、头孢拉定、头孢唑啉和头孢他啶。

1.2.4 细菌的耐药基因PCR 检测参照文献进行引物的合成，引物信息见表1。在提取细菌总DNA 基础上进行PCR 扩增。

2 结果

2.1 菌株的分离及生化鉴定结果在普通琼脂平板上呈现灰白色、湿润、圆形、半透明、表面凸起、直径约2mm 左右的菌落；在麦康凯平板上呈现红色、扁平、圆形、湿润、表面光滑、边缘整齐的中等大小的菌落。染色镜检结果呈现两端钝圆、大量中等大小的革兰氏阴性菌。初步鉴定了104 株E.coli，经过生化鉴定，有100 株与E.coli生化反应相符。

2.2 分离细菌16S rRNA 序列分析结果

16S rRNA 基因进行PCR 扩增、电泳检测，最终得到大小约为1500 bp 的目的基因条带。通过BLAST 比对，与大肠杆菌相应序列相似度在99%以上（图1），结合生化反应结果与细菌16S rRNA 基因序列分析结果，确定分离的细菌为E.coli。

图1 同源性分析结果

2.3 耐药表型检测结果将动物临床上常用的β-内酰胺类抗菌药物与E.coli生化特性相符的100 株菌进行的耐药表型检测，结果100 株E.coli对青霉素为100%、阿莫西林89%、头孢拉定80%、对头孢他啶和头孢唑林为1%，其中抗1 种药物的菌株有18 株，占18%，抗2 种药物的菌株有3 株，占3%，抗3 种药78 个，占78%，抗4 种药物的菌株有1 个，占1%，耐药菌株占总菌株的100%。结果详见表3。

表3 100 株绵羊源E.coli 对5 种β-内酰胺类药物的耐药表型

2.4 细菌的耐药基因PCR 检测结果对100 株E.coli进行SHV、TEM、CTX-M-1、CTX-M -2、CTX-M -9耐药基因扩增，其中98%（98/100）株检测到了TEM基因大小约为512 bp 的目的片段，100%（100/100）菌株检测到CTX-M-1大小约为864 bp 基因的目的片段，未检测到SHV、CTX-M-2和CTX-M -9基因片段。

3 讨论

在兽医临床中细菌耐药率的不断升高与广泛使用抗生素所造成的选择性压力有关，而β-内酰胺类药物则是应用最普遍的抗菌药物之一，在临床感染的治疗中发挥着重要的作用，因此致病性E.coli的耐药性也成为全球关注的问题。本研究从健康绵羊粪便中分离100 株羊正常菌群大肠杆菌，通过对5 种临床常用的β-内酰胺类药物进行耐药表型分析发现100 株菌对青霉素耐药率最高为100%，对阿莫西林和头孢拉定耐药率分别为89%、80%，对头孢他啶、头孢唑林耐药率最低均为1%，其中分离株对某些抗生素的耐药率甚至高于王鹏勇等报道禽源致病性E.coli的耐药率，如阿莫西林，低于张忠[12]报道宁夏地区人源临床分离株E.coli阿莫西林和头孢他啶的耐药率。本研究分离的E.coli的耐药谱型主要以CTX-M-1和TEM为主，耐药基因的检出率分别为100%和98%，是本研究中细菌耐药主要的耐药基因。菌株所含耐药基因类型越多，其耐药率越高。因此石河子地区部分羊源E.coli对β-内酰胺类抗菌药存在不同程度的耐药性。这一结果为本地区相关疾病的防控提供理论依据。