山仙颗粒对H22肝癌移植瘤微环境中淋巴细胞活性的调控作用

谢 敏，胥 冰，潘艳芳，方 艳，李 宏，李 媛，应小平

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

肝癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其易发生肝内外扩散、复发和转移，恶性程度高，预后较差，是全球第三大癌瘤死亡的主要原因[1]。在我国，肝癌的5年总体存活率只有50%～70%[2]。因此，迫切需要研发有效的抗肝癌药物。肿瘤微环境是肿瘤生长过程中所处的局部微环境，是由免疫细胞、基质细胞、细胞外基质、细胞因子、生长因子等组成的一个动态网络综合体，为肿瘤的生长提供必要的物质基础，不仅支持肿瘤的生长、侵袭和转移，且严密控制免疫系统对肿瘤细胞的识别、杀伤和抑制其转移的功能[3]。近年来中医药防治恶性肿瘤成为研究热点，主要体现在抗基因突变、细胞毒作用、诱导细胞凋亡、增强机体免疫力、抗肿瘤新生血管生成等[4]。 山仙颗粒为陕西中医药大学附属医院中西医结合肿瘤内科前辈们长期工作经验的结晶，属院内抗恶性肿瘤的纯中药制剂，具有抑制肿瘤形成、延缓病情进展等作用，前期动物实验证实其可以通过增强T细胞活性而抑制肿瘤细胞增殖及促进Caspase-3、Caspase-9介导的肿瘤细胞凋亡[5-6]。但该方是否可以通过调控肝癌免疫微环境以抑制其生长、复发、转移尚不清楚，因此本实验旨在通过观察山仙颗粒对H22肝癌移植瘤组织中干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子-β(TGF-β)含量的影响，以探讨山仙颗粒对H22肝癌移植瘤微环境中淋巴细胞活性及相关细胞因子的调控作用。

1 实验材料与方法

1.1材料

1.1.1肿瘤细胞株 小鼠H22肝癌细胞株，购于空军军医大学实验动物中心。

1.1.2实验动物 SPF级雄性昆明小鼠50只，周龄5～6周，体重18～22 g。西安交通大学实验动物中心提供，动物合格许可证号：SCXK(陕2012-003)。动物房温度20～22 ℃，湿度50%～60%，每隔6 h通风换气1次，保持无太阳直射和噪声干扰。

1.1.3主要药物及试剂 山仙颗粒主要由西洋参、龟板、鳖甲、生山楂等组成，由陕西中医药大学附属医院中成药房提供(生产批号：20150114)，规格：10 mg/包；生理盐水，由西安利君制药厂提供(生产批号：150415)； ELISA试剂盒，购于武汉新启迪生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1瘤细胞悬液的制备 将1 mL低温冻存的H22细胞置于38 ℃恒温水浴箱中快速溶解3 min，用PBS溶液调整为1×107个/mL细胞混悬液，昆明小鼠腹腔内传代，常规饲养1周，无菌抽取腹水，并调整为1×107个/mL瘤细胞悬液，备用。

1.2.2山仙颗粒混悬液制备 根据人、鼠体重用药剂量换算方法，用生理盐水将山仙颗粒配制成低、中、高浓度混悬液，山仙颗粒与生理盐水比例分别1∶40，1∶20及1∶10，即0.025 g/mL、0.05 g/mL、0.1 g/mL，保存于4 ℃冰箱，备用。

1.2.3分组、造模及干预 小鼠适应性饲养1周后，随机选择40只进行造模：将H22瘤细胞悬液0.1 mL(约1×106个瘤细胞)接种于小鼠右前肢腋窝皮下，编号，并随机分为模型组和山仙颗粒低、中、高剂量组，每组10只。剩余10只作为空白组，右前肢腋窝皮下注射0.1 mL生理盐水。实验小鼠于造模开始24 h内禁食但不禁水，24 h后对各组小鼠称重并记录。每天于8:00和20:00，山仙颗粒低、中、高剂量组分别给予山仙颗粒混悬液0.025 g/mL、0.05 g/mL、0.1 g/mL各灌胃1次，空白组与模型组给予等量生理盐水灌胃，均连续灌胃30 d。

1.3观察指标及方法

1.3.1一般情况 灌胃期间观察各组小鼠状态、毛色、饮食饮水、体重等情况。

1.3.2抑瘤率 各组小鼠于末次灌胃24 h后称重并记录，颈椎脱臼法处死，75%酒精消毒，置于超净工作台，剥离瘤组织，称重并记录,根据瘤组织重量计算抑瘤率。抑瘤率=(模型组瘤重平均值 - 治疗组瘤重平均值)/ 模型组瘤重平均值×100%。

1.3.3移植瘤组织中IFN-γ、IL-6、TGF-β含量采用ELISA法检测：取造模各组小鼠1/4新鲜瘤组织和空白组脾组织，PBS洗涤，加入相应比例的PBS在冰水中匀浆、离心，取上清，从密封袋中取出实验所需要的板条，预留空白孔。加入备好的血清和标准品，37 ℃反应90 min，洗板3次，加入生物素化TGF-β抗体工作液,37 ℃反应60 min，洗板3次，加酶结合物工作液(除空白孔外)，37 ℃反应30 min，洗板5次，TMB显色，终止显色，测量OD值(450 nm) 。用同样实验步骤检测IFN-γ、IL-6含量。

2 结 果

2.1各组小鼠一般情况 灌胃期间，空白组小鼠状态良好，体重持续增加，对外界刺激反应灵敏，毛色光亮；模型组小鼠从第6天开始出现进食减少及饮水减少现象，随着实验时间推进，腋下瘤块逐渐明显，实验最后，肿瘤已限制小鼠活动，右肢功能基本丧失，右爪抓握能力减弱，小鼠瘦弱，毛色枯槁无光泽；山仙颗粒低剂量组小鼠饮食明显减少，活动减少，体重增长十分缓慢，对外界刺激反应较迟钝，右侧腋下瘤块肉眼可见；山仙颗粒中剂量组小鼠整体情况好于山仙颗粒低剂量组及模型组，山仙颗粒高剂量组小鼠的整体情况优于山仙颗粒中剂量组。

2.2各组小鼠移植瘤重量及抑瘤率比较 山仙颗粒各组瘤体重量明显轻于模型组(P均<0.05)，且山仙颗粒中、高剂量组明显轻于山仙颗粒低剂量组(P均<0.05)，山仙颗粒高剂量组明显轻于山仙颗粒中剂量组(P<0.05)；山仙颗粒中、高剂量组抑制率明显高于山仙颗粒低剂量组(P均<0.05)，山仙颗粒高剂量组明显高于山仙颗粒中剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠H22肝癌移植瘤重量及抑瘤率比较

2.3各组小鼠移植瘤组织中IFN-γ、IL-6、TGF-β含量比较 与空白组比较，模型组移植瘤组织中IFN-γ含量明显降低(P<0.05)，IL-6、TGF-β含量均明显增高(P均<0.05)；与模型组比较，山仙颗粒各组移植瘤组织中IFN-γ含量明显增高(P均<0.05)，IL-6、TGF-β含量均明显降低(P均<0.05)；山仙颗粒高剂量组移植瘤组织中IFN-γ、IL-6、TGF-β含量变化更明显，其次为山仙颗粒中剂量组，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 空白组小鼠肝组织和H22肝癌各组小鼠移植瘤组织中IFN-γ、IL-6、TGF-β含量比较

3 讨 论

在肿瘤微环境中存在着大量由免疫细胞(T细胞、B细胞、NK细胞等)和非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞)组成的细胞因子，其中T淋巴细胞主要表达两种不同的细胞因子即1型(Th1)和2型(Th2)[7]。 IFN-γ主要是由Th1型细胞分泌的细胞因子，其参与调节细胞免疫，可增强巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达,具有抗肿瘤作用，同时还可以活化自然杀伤细胞，提高体内免疫监视作用，防止肿瘤细胞发生免疫逃逸等[8]。方艳等[9]实验表明，山仙颗粒可能通过上调外周血中IFN-γ含量，提高小鼠体内CD4+T淋巴细胞含量、增强T淋巴细胞活性，从而抑制Lewis肺癌细胞的增殖。本实验研究结果显示，山仙颗粒可缩小小鼠H22肝癌移植瘤体积，提高移植瘤组织中IFN-γ含量，且具有剂量依赖性。表明山仙颗粒可能通过上调肿瘤组织中IFN-γ的含量以提高机体抗肿瘤免疫作用，抑制肿瘤细胞增殖。

IL-6主要是由Th2型细胞产生的细胞因子，主要参与调节多种细胞的生长与分化，调节免疫应答，并在机体的抗感染免疫反应中扮演着重要的角色[10]。研究发现，一些实体肿瘤如宫颈癌、胃癌、肝癌患者血清IL-6含量明显高于正常人[11]，且IL-6在体内的高表达与多种恶性肿瘤的愈后关系密切[12]。除此之外，IL-6也是肿瘤微环境中存在的炎症因子之一，它能够影响肿瘤细胞的增殖与转移并促进肿瘤恶化，形成肿瘤炎性微环境，加快肿瘤新生血管形成等[13]，因此下调IL-6含量可以在一定程度上抑制肿瘤的进展。TGF-β是一组能够调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，活化的T细胞、所有肿瘤细胞均可分泌TGF-β。 TGF-β能够抑制免疫活性细胞的增殖、淋巴细胞的分化及细胞因子的产生，可诱导肿瘤细胞发生免疫逃逸及肿瘤细胞上皮-间质转化等[14]。因此，抑制TGF-β在体内的表达具有重要的抗肿瘤意义。王晓群等[15]研究发现消岩汤(生黄芪、太子参、郁金、姜黄、夏枯草、生牡蛎、白花蛇舌草)对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用与其下调免疫负向调节因子TGF-β的水平相关。本实验结果显示，山仙颗粒低、中、高剂量组移植瘤组织中IL-6、TGF-β含量依次降低，移植瘤体积依次缩小，表明山仙颗粒可能通过下调肿瘤组织中IL-6、TGF-β的含量,提高实验小鼠机体免疫力以改善肿瘤微环境，从而抑制肿瘤细胞增殖。

综上所述，推测H22肝癌细胞可分泌TGF-β，且在缺氧、低pH的微环境中迅速活化，从而抑制T淋巴细胞增殖、淋巴细胞与内皮细胞黏附及IFN-γ产生；IFN-γ可抑制CD4、CD45RO前体细胞向Th2分化，当IFN-γ低表达时，该抑制作用减弱，分化成熟的Th2细胞增多，IL-6的分泌随之增多。山仙颗粒对H22肝癌移植瘤的生长具有抑制作用, 且抑瘤率与药物剂量呈正相关。山仙颗粒可能通过抑制T淋巴细胞和(或)H22肝癌细胞分泌TGF-β，或者改善肿瘤微环境以抑制TGF-β活化，下调TGF-β、IL-6表达，上调IFN-γ表达从而调控肿瘤微环境中淋巴细胞的活性。但由于山仙颗粒组成成分多样，具体是哪一种药物或化学成分通过何种通路调控肿瘤微环境中的细胞因子而达到抗肿瘤作用尚有待于进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。