花生五烯酸与透明质酸接枝物的合成及其抗肝癌活性

崔 杰，夏一帆，张文典，段少峰

（1河南大学药学院，开封 457001；2广东省人民医院(广东省医学科学院)，广州 510080）

肝癌是全球第4 大肿瘤，与总体肿瘤病死率的下降趋势相反，在过去的几十年中，肝癌的发病率和病死率逐年上升［19］。虽然传统的治疗手段收效甚微，但是随着纳米医学的兴起，利用纳米材料靶向递送药物为肝癌的治疗带来了新的解决方法［20-21］。

本研究所用花生五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是一种广泛存在于海洋动植物中的ω-3不饱和脂肪酸。目前大量药理研究表明EPA 对肝癌具有抑制作用，但是其作为一种常见的食用补剂，虽有一定的效果，但相对化疗药物而言还有很大的差距。透明质酸（hyaluronic acid，HA）由于其优秀的亲水性、长循环和安全性被广泛用于脂溶性化合物的药物递送［22］。庞鑫等［23］通过HA 接枝槲皮素，发现HA 作为载体，在同等药物浓度水平下，能向肿瘤细胞内释放更多的药物，从而产生更强的细胞杀伤作用。赖华禄等［24］制备了前药结合物HA-ADH-Cur，带有负电性的HA外壳，导致纳米颗粒倾向于聚集在肿瘤组织中，全身毒性较低。于是本研究通过化学接枝的方法将HA 和EPA 偶联，以期提高EPA 的肝癌抑制作用与安全性，增加其临床应用的可能性。实验最终合成了一种EPA接枝物，利用核磁共振（1H NMR）和傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）进行了结构表征；DLS 法测量了粒径与电位；对其进行了肝癌细胞HepG2、Huh-7和正常肝细胞LX-2 体外活性评价，并通过EdU 染色法评价了对HepG2 的增殖抑制作用，通过TUNEL 和流式细胞仪评价对HepG2的凋亡促进作用，通过Transwell 和Invasion 评价了对肝癌细胞的迁移和侵袭能力的影响。

1 材 料

1. 1 药品与试剂

胱胺二盐酸盐（cystamine dihydrochloride，上海萨恩化学技术有限公司）；EPA（江苏艾康医药科技有限公司）；HA（Mr8 000，山东福瑞达生物医药有限公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；多聚甲醛固定液、结晶紫染色液（上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM 培养基、DAPI 染色液、AnnexinV Alexa Fluor488/PI 凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；EdU/Apollo567 细胞增殖检测试剂盒、TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）；Transwell 小室、Inva⁃sion 小室（美国Corning 公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1. 2 仪 器

ZEN3690 激光粒度仪（英国马尔文公司）；is50 FT-IR 红外分光光度计（美国热电有限公司）；Avance Ⅲ全数字化超导核磁共振谱仪（瑞士布鲁克有限公司）；IX53 倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯股份公司）；FACS Verse 型流式细胞仪（美国BD生物科技有限公司）；酶联免疫检测仪（美国赛默飞世公司）。

1. 3 细 胞

人肝癌细胞Huh-7、HepG2 与人肝星形细胞LX-2均由河南大学医学院提供。

2 方 法

2. 1 HA-EPA的合成

2. 1. 1 透明质酸-胺(HA-amine)的合成 精密称取透明质酸20 mmol 溶于去离子水中，依次加入EDC·HCl 24 mmol、胱胺二盐酸盐60 mmol，用2 mol/L HCl 将溶液pH 调至4. 75，室温搅拌反应2 h 后，加入1 mol/L NaOH 将溶液pH 调至7，然后终止反应。取反应液于截留分子量为8 000 透析袋中，去离子水透析48 h，每4 小时换一次透析水。透析完液体冷冻干燥24 h，得乳白色蓬松固体。

副中心周边的农村公路，在实际生活中已经半兼顾城市道路的功能，但道路等级依然是农村公路属性. 对于这部分农村公路规划应着眼于未来，尤其应注重提升慢行交通、景观生态、公共交通以及智能交通管理在规划中的地位，同时使其满足可以铺设市政管线的要求. 首先要进行改造升级，如道路宽度不够、交通基础设施不健全等问题要全面考虑，改造同时可将重心转移到大力发展公共交通的目标上，有条件的地区可设置交通专用道，从而为公交线路更广泛的覆盖农村地区，方便农村居民的出行提供有力条件. 对于居民出行需求强烈的地区，道路设计要求机非分离.

2. 1. 2 二十碳五烯酸琥珀酸单酯活化物(EPANHS)的合成 将0. 5 mmol EPA溶于干燥的二氯甲烷中，先后加入0. 6 mmol NHS，1 mmol EDC·HCl，室温搅拌6 h；薄层色谱法监测反应结束后，旋干溶剂得粗产物黄色固体，直接用于下一步反应。

2. 1. 3 HA-EPA 的合成 取HA-amine 1 mmol 与EPA-NHS 粗产品1. 2 mmol 共溶于二甲基甲酰胺10 mL，于室温反应过夜；待反应结束后，将反应液装入截留分子量为3 500 的透析袋，于去离子水中透析48 h除去小分子量副产物，每4小时换一次透析水；透析后的产物置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥24 h，得产品为淡黄色蓬松固体。

2. 2 HA-EPA的表征

2. 2. 11H NMR 表征 称取HA-EPA 15 mg，以DMSO-d6为溶剂将产物溶解，利用核磁共振仪测定产物的核磁共振氢谱（1H NMR）。

2. 2. 2 FT-IR 表征 取适量HA-EPA，用FT-IR 系统分析产物，对终产物进行结构佐证。

2. 2. 3 平均粒径、多分散系数(PDI)和Zeta 电位的测定 取适量HA-EPA 固体，用蒸馏水稀释后，采用马尔文ZEN3690 激光粒度仪测定粒径、分散系数和Zeta电位。

2. 3 HA-EPA 对于HepG2的增殖、凋亡、迁移与侵袭能力的影响

通过MTT 法验证了HA-EPA 对正常肝细胞LX-2 的毒性，并测得了不同浓度与时间下HepG2和Huh-7的细胞存活率；通过EdU、TUNEL、流式凋亡、Transwell 与Invasion 实验检测250 μmol/L HA、EPA 和HA-EPA 给药后HepG2 的增殖、凋亡、迁移与侵袭相关能力的影响。

2. 3. 1 HepG2、Huh-7、LX-2细胞的培养 HepG2、Huh-7、LX-2 细胞用含有1% 青霉素链霉素和10%FBS的DMEM培养基培养。待细胞生长稳定后，取处于对数生长期的细胞用于体外细胞实验。

2. 3. 2 细胞毒活性实验 采用MTT 法测试EPA与HA-EPA 对人肝癌细胞HepG2、Huh-7 及正常肝细胞LX-2 的体外活性实验。于96 孔板每孔加100 μL 含细胞培养液，每孔1 × 104~ 2 × 104个细胞，贴壁稳定后，每孔加入含药培养液100 μL，终浓度为0，25，50，100，200，400 μmol/L，每组5 个复孔，分别培育24，48，72 h。0. 5 % PBS 配制的MTT溶液加入细胞孔，每孔20 μL，培养箱中孵育4 h。弃上清液，每孔DMSO 150 μL，用酶联免疫检测仪孵育10 min 测定每孔在波长为570 nm 处的吸收度，计算细胞活力。

2. 3. 3 细胞增殖实验 96 孔板每孔2 × 104个HepG2 细胞，配制空白对照，250 μmol/L HA、EPA和HA-EPA 培养基溶液给药24 h，每组3 个复孔。EdU 孵育，多聚甲醛固定液固定，Apollo567 染色，DAPI 染色，荧光显微镜进行成像，计算细胞增殖率。

2. 3. 4 细胞凋亡实验 铺板给药同细胞增殖实验，给药24 h 后弃培养液，固定细胞，加TUNEL 检测液，DAPI 染色，荧光显微镜成像，计算细胞凋亡率。HepG2 细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种于12 孔板，贴壁给药24 h 后，收集细胞，AnnexinV Alexa Fluor488与PI染色，流式细胞仪检测。

2. 3. 5 细胞迁移与侵袭实验 准备Transwell 小室，下室为20% FBS 培养基，上室为4 × 104个HepG2 细胞和上述不同组药物无血清培养液，培养24 h 后，将穿过小室的细胞固定、结晶紫染色液染色，于显微镜（100 ×）下拍照并计算细胞迁移数。准备侵袭小室，加入完全培养基200 μL 并置于培养箱中活化30 min，其余操作同上，计算细胞侵袭数。

2. 4 统计分析

采用GraphPad Prism 5 软件对实验数据进行描述性统计，计量资料结果以±s表示，两组之间比较选用t检验和方差分析，P＜0. 05 表明差异有统计学意义。

3 结 果

3. 1 HA-EPA的合成

HA 和EPA 都含有羧基，胱胺两端为氨基。本研究以酰胺反应为合成手段，以EDC 和NHS 为催化剂，先合成氨基化的透明质酸（HA-amine），再将活化的EPA 与之反应，将HA 与EPA 通过胱胺相连，将EPA 成功与HA 相连，合成了HA-EPA，合成路线如图1所示。

Figure 1 Synthesis of hyaluronic acid (HA)- eicosapentaenoic acid (EPA)

3. 2 1H NMR图谱解析

HA、EPA 和HA-EPA 的1H NMR 图谱如图2 所示。图2-A 为HA 的1H NMR 图谱，δ4. 79 为溶剂（D2O）峰，δ4. 50，4. 40 两个双重峰为HA 的半缩醛的两个质子峰，δ1. 96 的峰为HA 的甲基质子峰，δ3. 78 ~ 3. 29 为HA 的剩余质子峰。图2-B 为EPA核磁氢谱图，δ7. 26 为溶剂（CDCl3）峰，δ5. 56 ~5. 22 的多重峰为烯烃的10 个质子峰，δ2. 83 为二烯间亚甲基的8 个质子峰，δ2. 36 ~ 1. 71 为剩余亚甲基的8 个质子峰，δ0. 97 的三重峰为末端甲基质子峰。图2-C 中HA-EPA 接枝物1H NMR 结果显示除了δ3. 54 ~ 3. 67 处出现了较强的HA 的峰外，在δ5. 56 ~ 5. 22、δ2. 83、δ0. 97处出现了EPA 结构上的质子信号峰，此为EPA 的特征信号峰，由此推断HA-EPA 已成功合成，且由HA 在δ4. 50 ~ 4. 40 的积分值1. 00（两个质子峰）与EPA 在δ5. 56 ~ 5. 22的积分值2. 01（10个质子峰）和δ0. 94 ~ 0. 89的积分值0. 60（3 个质子峰）的比值推算，EPA 在HA 上的接枝率约40%。

Figure 2 1H NMR spectra of HA in D2O (A); EPA in CDCl3 (B);HAEPA in DMSO-d6 (C)

3. 3 FT-IR图谱解析

如图3 所示，EPA 的红外特征峰有3 011 cm-1不饱和烯烃的伸缩振动峰，2 963 cm-1饱和C-H 的伸缩振动峰，1 413 cm-1为-CH2-的弯曲振动峰，1 705 cm-1为羰基的伸缩振动，1 239 cm-1为C-O-C的伸缩振动；HA 的红外特征峰有3 385 cm-1的-OH伸缩振动峰，2 895 cm-1的C-H 伸缩振动峰，1 046 cm-1的C-O-C 伸缩振动峰；HA-EPA 中1 553 cm-1的-NH的弯曲振动，1 375 cm-1的C-N的伸缩振动证明了新的酰胺键的存在，3 312 cm-1，2 934 cm-1，1 077 cm-1的峰为HA 的特征峰，1 737 cm-1，1 648 cm-1的峰为EPA 羰基和顺式双键的伸缩振动，从而证实所合成的接枝物为所需要的目标化合物。

Figure 3 IR spectra of EPA (A), HA (B) and HA-EPA (C)

3. 4 平均粒径、多分散系数(PDI)和Zeta电位

采用激光粒度仪测定各项指标。测得HAEPA 的平均粒径为（162. 5 ± 10. 2）nm，PDI 为0. 188 ± 0. 09。经电位分析测试接枝物的Zeta 电位为-（4. 47 ± 0. 31）mV。

3. 5 细胞毒活性实验

如图4 所示，HepG2 与Huh-7 的细胞活力随着EPA 与HA-EPA 的浓度增大而减小，作用时间越长，细胞活力也相应减小。相同EPA 含量下的HA-EPA 较于单体有更强的抑制效果。本研究进一步考察了EPA 与HA-EPA 对人正常肝细胞LX-2的影响。如图5 所示，对于LX-2 而言，同样浓度的HA-EPA 相较于单体EPA 处理48 h 细胞存活率更高。

3. 6 细胞增殖实验

如图6 所示，染色后，荧光显微镜可见经HAEPA 处理后，该组HepG2 增殖数量远远低于对照组与HA组，显著优于EPA组。

Figure 4 Cell viability of HepG2 cells (A) and Huh-7 cells (B) treated by EPA or HA-EPA for 24, 48, 72 h (±s, n = 3)

Figure 5 Cell viability of LX-2 cells treated by EPA or HA-EPA for 48 h (±s, n = 3)

3. 7 细胞凋亡实验

如图7 所示，TUNEL 实验结果表明，HA-EPA处理过的HepG2 细胞，被标记的凋亡细胞相对其余组增多明显，HA-EPA组显著多于EPA组。

进一步采用流式细胞术对细胞凋亡进行检测，HA-EPA 组Annexin V 阳性细胞最多，这与TUNEL 结果一致，表明HA-EPA 相较于EPA，具有显著的促进HepG2凋亡作用。

Figure 6 EdU proliferation assay analysis of the effect of HA, EPA and HA-EPA on the growth of HepG2 cells (±s, n = 3)A: Typical photos; B: Quantitation of cell proliferation****P ＜0. 000 1 vs control group; ++++P ＜0. 000 1 vs HA group; &&&&P ＜0. 000 1 vs EPA group

Figure 7 Analysis of apoptosis by TUNEL labeling in HepG2 cells (A-B) and apoptosis cells detected by flow cytometry (C) (±s, n = 3)****P ＜0. 000 1 vs control group; ++++P ＜0. 000 1 vs HA group; &&&&P ＜0. 000 1 vs EPA group

3. 8 细胞迁移与侵袭实验

实验结果如图8所示，Transwell 小室底部的细胞数，HA-EPA 组明显低于其余3 组。侵袭小室底部HepG2 细胞的侵袭数量远远小于对照组，且HA-EPA 与EPA 组相比，其抑制作用同样存在显著性差异。综上，HA-EPA 可抑制人肝癌HepG2细胞的迁移、侵袭能力，且其作用显著优于EPA单体。

Figure 8 Effects of HA-EPA on the migration and invasion of HepG2 cells. The migration (A) and invasion (C) abilities of HepG2 cells were mea⁃sured by Transwell and invasion assay; and the numbers of the migrated cells (B) and the invasive cells (D) were calculated (±s, n = 3)***P ＜0. 001, ****P ＜0. 000 1 vs control group; +++P ＜0. 001, ++++P ＜0. 000 1 vs HA group;&&&&P ＜0. 000 1 vs EPA group

4 讨 论

本研究将HA 与EPA 通过化学反应接枝在一起得到HA-EPA 接枝物，通过1H NMR 和FT-IR确定了目标产物的成功合成，且通过1H NMR 确定了EPA 在HA 上的接枝率约40%；测定了产物的粒径及电位，结果分别为（162. 5 ± 10. 2）nm 和-（4. 47 ± 0. 31）mV。

接下来，通过MTT 实验检测了HA-EPA 对肝癌细胞HepG2 和Huh-7 的毒性实验，HA-EPA 与EPA 单体相比，HA-EPA 能更好地抑制肿瘤增长，且具有时间与剂量依赖性。对正常细胞LX-2 的MTT 结果表明，HA 的负载有效减少了EPA 对正常细胞的毒性作用。

本研究通过对肝母细胞瘤细胞HepG2 的增殖、凋亡、迁移、侵袭实验，初步探究了HA-EPA 对肝癌细胞的体外抑制作用，相较于EPA 单体，HAEPA 能显著抑制HepG2 的增殖、迁移与侵袭，促进HepG2的凋亡。

综合以上结果，HA-EPA 具有出色的生物安全性以及抗肝癌效果，具有较好的应用前景，未来可进一步用于肿瘤治疗与药物递送，HA-EPA 的抗肝癌分子机制研究将在后期研究中进行。