温度响应型酰腙可逆共价键水凝胶的制备及性能

2022-03-12罗媛媛张银山郭赞如章家立

功能高分子学报 2022年1期

何元，罗媛媛，刘通，张银山，郭赞如，章家立

（1. 华东交通大学材料科学与工程学院，高分子材料与工程系，南昌 330013；2. 重庆市计量质量检测研究院，重庆 401120）

智能水凝胶能够随着环境（如pH、温度、光、电等）的微小变化而发生可逆体积相变、溶胶-凝胶相转变或其他物理化学性质变化[1]，在组织工程[2]和药物控释[3]等领域具有广阔的应用前景。动态共价键构建的智能水凝胶因其良好的热力学稳定性而受到青睐[4]。动态共价键又称为可逆共价键，在外界环境微调情况下可实现可逆变化[5]。酰肼和酮羰基或醛基在中性或弱酸性条件下形成的酰腙键是典型的动态共价键之一[6,7]。Wang 等[8]制备了基于动态共价酰腙键交联的自愈合水凝胶，基于酰腙键的可逆性，该水凝胶具有溶胶-凝胶转变性能。Deng 等[9]制备了一种基于醛基和酰肼动态共价酰腙键的自修复聚合物凝胶，它在一定的pH 条件下可进行溶胶-凝胶转变。Smeet 等[10]设计了可注射酰腙键交联水凝胶，由于其灵活且易于调节，该凝胶有望应用在生物材料领域。考虑到高活性的醛基能够和蛋白质中的基团反应而具有毒性风险，本课题组利用酮羰基和酰肼反应，构建了一系列具有溶胶-凝胶可逆转变以及自愈合性能的动态可逆共价键水凝胶[6,7,11]。Chang 等[12]基于动态共价酰腙键制备了具有可逆温度响应性的自愈合水凝胶，该凝胶展现出对人体体温的温度响应性。An 等[13]制备了可调控的温度响应性水凝胶，该水凝胶表现出基于可逆酰腙键的自愈合性能、温和的碱降解性和生物相容性。目前利用酰腙键构建水凝胶的研究报道中，温度对水凝胶的稳定性和自愈合性的影响鲜有报道，对响应温度的调控也缺乏细致研究。

本文首先通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合制备了共聚物聚丙烯酰胺-co-聚双丙酮丙烯酰胺-co-聚N-异丙基丙烯酰胺（PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM）；然后使该共聚物和己二酸己二酰肼（ADH）反应，得到了含可逆共价酰腙键水凝胶。可逆共价酰腙键可以通过pH 调控其溶胶-凝胶转变，同时可以通过调节温度调控水凝胶的稳定性和自愈合性能。此外，本文试探性地将水凝胶作为药物载体，考察了水凝胶的药物释放行为。

1 实验部分

1.1 原料与试剂

丙烯酰胺（AM）、偶氮二异丁腈（AIBN）、ADH、阿霉素（Dox）：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；双丙酮丙烯酰胺（DAAM）、N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）：分析纯，东京化成工业株式会社；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 测试与表征

核磁共振仪：瑞士布鲁克公司AVANCE 300 型，将共聚物溶于D2O 中，在25 ℃下测试; 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）仪：美国热电公司Nicolet 6 700 型，使用KBr 压片法制样，测试范围4 000～500 cm−1；凝胶渗透色谱（GPC）仪：美国沃特世有限公司Waters 2 410 型，聚氧乙烯醚（PEO）为参比物，0.1 mol/L 的 NaNO3溶液为洗涤液；紫外-可见光谱仪：日本 Hitashi 公司，测定共聚物溶液透光率随温度的变化，共聚物溶液的质量浓度为10 mg/mL；流变仪：奥地利Anton Paar 公司MCR 302 型，采用变频扫描模式，固定应变（ε）为 1%（凝胶处于线性黏弹区），频率范围为 0.628～100 s−1；扫描电镜子显微镜（SEM）：日本JEOL 公司JSM-7500F 型，凝胶样品经冷冻干燥后进行观察。

1.3 共聚物PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM 的制备

首先按文献报道的方法[14]制备相催化链转移剂（CTA）。通过RAFT 聚合的方法制备PAM-co-PDAAMco-PNIPAM。按照表1 投料配比，在三口瓶中加入NIPAM、AM 和DAAM，以及25 mL 二甲基亚砜（DMSO），在搅拌下通入N2脱气处理30 min，在N2的保护下，加入CTA 0.092 2 g（0.252 mmol）和AIBN 2.1 mg（0.013 mmol），继续通入N2搅拌15 min，升温至70 ℃反应24 h。反应完毕后将反应物逐滴滴加到大量静置乙醚中过滤沉淀得到沉降物。室温下将沉降物真空干燥24 h，即得到PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM。依据表1 中的投料比，将共聚物标记为P1、P2、P3、P4、P5。

1.4 共聚物的低临界溶解温度（LCST）测定

取0.05 g 共聚物溶解在5 mL 去离子水中，共聚物溶液质量浓度为10 mg/mL。利用紫外-可见光谱仪绘制共聚物溶液在500 nm 波长下透光率随温度的变化曲线，曲线中透过率下降50%所对应的温度为共聚物的LCST[8]。

1.5 水凝胶的制备

将0.5 g 的共聚物溶解在4.5 mL 水中，并加入ADH（其用量为共聚物中DAAM 单元物质的量的0.5 倍），待ADH 溶解之后，用盐酸（3 mol/L）或NaOH（3 mol/L）调节混合溶液的pH，即得到水凝胶。共聚物P1、P2、P3、P4、P5 制得的水凝胶分别记为HG1、HG2、HG3、HG4、HG5。

1.6 水凝胶的 pH 响应性

配制固含量（w（HG）=m（Copolymer）/m（Hydrogel））为10%的水凝胶。溶胶-凝胶转变过程用3 mol/L 的盐酸或3 mol/L 的NaOH 调节pH。

1.7 水凝胶温度响应的体积相变

将固含量为10%的圆柱形（高为0.5 cm，直径为1.0 cm）水凝胶，置于不同温度下，记录水凝胶的体积变化，计算其温度响应后的体积收缩率（ΔV）。

1.8 水凝胶的自愈合性能

选用2 块大小相同的三角形形状的水凝胶，将其中一块用诱惑红染色。2 块水凝胶分别切割成4 小块，然后再将其紧密拼凑在一起。在设定温度下放置6 h，观察水凝胶的自愈合能力。

1.9 水凝胶的稳定性及药物控释行为

配制4 块同等大小、固含量为10% 的水凝胶HG5，分别将其置于不同pH 和温度的磷酸盐缓冲（PBS）溶液中，每隔1 h 记录其质量，绘制水凝胶质量随时间变化的曲线。以固含量为10% 的水凝胶HG5 作为药物载体，将5 mg Dox 溶于10 mL 的P5 共聚物溶液中，加入0.087 6 g 的ADH，调节混合溶液的pH=5，制备负载Dox 的水凝胶。然后将其浸泡在不同pH 和温度的50 mL PBS 溶液中，测试在485 nm 处的紫外吸收，计算不同时刻的Dox 释放量，绘制载药水凝胶的Dox 累积释放量随时间变化曲线。

2 结果与讨论

2.1 聚合物的结构及分子量表征

共聚物的FT-IR 分析如图1（a）所示。3 288～3 438 cm−1处为共聚物中N−H 的伸缩振动吸收峰，1 711 cm−1处为DAAM 单元中酮羰基的特征吸收峰，1 653 cm−1处为共聚物中酰胺的羰基伸缩振动吸收峰，1 550 cm−1处为共聚物中N−H 的弯曲振动和C−N 的伸缩振动吸收峰[6,12]。该结果说明共聚物由AM、DAAM 与NIPAM 3种单体聚合而成。图1（b）为共聚物的1H-NMR 谱图，化学位移0.9～1.2 处为NIPAM 单元上−CH3的氢质子峰，0.9～1.2 处为DAAM 单元上−（CH3）2C−的氢质子峰，1.2～1.8 处为主链上−CH2−的氢质子峰，1.8～2.3 处为主链上−CH−和DAAM 单元上−CH3的氢质子峰，2.8～3.3 处为DAAM 单元上−CH2−的氢质子峰，3.7～4.0 处为NIPAM单元上−CH−的氢质子峰。基于1H-NMR谱图上相应质子峰的积分面积（A），根据公式（nAM:nDAAM:nNIPAM=2(Ab,d−2Ac−Ag):Ac:2Ag，A为峰面积）可以计算出共聚物中AM、DAAM和NIPAM的物质的量之比，计算结果列于表1。

表1 共聚物的组成及参数Table 1 Composition and parameters of polymers

图1 PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM 的（a）红外谱图和（b） 1H-NMR 谱图Fig. 1 （a）FT-IR and （b）1H-NMR spectra of PAM-co-PDAAM-co-PNIPAM

从表1 可见：产物各组份的比例与投料比有微小差别，这是单体位阻效应所导致的结果[15]。1H-NMR 和FT-IR 的分析结果说明成功地合成了不同组成的共聚物。

2.2 聚合物的LCST

图2（a）为共聚物溶液透光率随着温度的变化曲线。共聚物P1、P2、P3、P4 与P5 的LCST 分别为25.1 、27.1、28.0、30.5、36.1 ℃，说明可通过调控AM 单元的量得到不同LCST 的共聚物。此外，P1、P2、P3、P4 的LCST 低于纯PNIPAM 的LCST[16]，这是由于DAAM 单元的加入使共聚物的疏水性增强，继而降低其LCST[17]。随着共聚物中AM 单元的增加，其亲水性增加，共聚物的LCST 随之升高。此外，共聚物的LCST 随PAM 单元的增加而增加（图2（b）），说明该类共聚物能够通过控制PAM 单元的量实现响应温度的调控。

图2 （a）共聚物溶液透光率随温度的变化曲线；（b）共聚物的LCST 随AM 摩尔分数的变化Fig. 2 （a）Temperature dependence of optical transmittance for polymer aqueous solution; （b）LCST of polymers varied with the mole fraction of AM

2.3 水凝胶的形成及流变性能

图3（a）为水凝胶的模量对频率的动态流变关系，图中储能模量（G′）恒大于损耗模量（G″）。这是典型的水凝胶流变行为[6,11]，说明共聚物与ADH 形成了水凝胶。另外，HG1～HG5 水凝胶的模量基本相当，这是由于共聚物（P1～P5）中DAAM 单元的含量接近，形成的交联点数量也接近。ADH 用量对水凝胶模量的影响如图3（b）和图3（c）所示，随着酰肼与酮羰基的比例（r=n（Hydrazide）:n（Ketone））增加，水凝胶的模量增加。当ADH 的用量进一步增加，过量的ADH 反而会影响水凝胶的模量，使之下降。形成水凝胶的最佳比例是r=1。从图3（d）可见，水凝胶的模量还随着水凝胶固含量的增大而升高。

图3 （a）水凝胶的模量对频率动态流变曲线；（b）不同酰肼与酮羰基比水凝胶（w（HG5）=10%）的模量对频率动态流变关系；（c）HG5（w（HG5）=10%）的储能模量G′ 随酰肼与酮羰基比例的变化；（d）HG5 的模量对频率的动态流变关系Fig. 3 （a）Dynamic rheological curves of hydrogels modulus changing with frequency; （b）Dynamic rheology of HG5（w(HG5)=10%）prepared by different hydrazide/ketocarbonyl mole ratio with frequency change; （c） G' of HG5（w (HG5)=10%） varies with the mole ratio of hydrazide to ketocarbonyl group; （d）Dynamic rheology of HG5 modulus with frequency change

2.4 水凝胶的pH 响应性

如图4（a）所示，当pH =5.0 时，共聚物与ADH 形成了水凝胶；当pH =2.0 时，水凝胶转变为溶液。调节体系的pH，水凝胶出现可逆的溶胶-凝胶转变，表明水凝胶具有pH 响应性。对溶胶-凝胶转变过程进行的FT-IR 分析如图4（b）所示，当pH =7.0 时，在1 720 cm−1处观察到DAAM 单元上C=O 的吸收峰；当pH=5.0 时，1 720 cm−1处的C=O 峰消失，而在 1 665 cm−1处出现了一个新的C=N 吸收峰，表明酮羰基和酰肼键形成了酰腙键[5-11]。当pH=2.0 时，1 665 cm−1处C=N 键的吸收峰消失，而 1 720 cm−1处的C=O 吸收峰再次出现，说明酰腙键发生了断裂。分析证明调节溶液的pH，可使酰腙键的形成和断裂可逆进行，水凝胶具有溶胶-凝胶转变性能。

2.5 水凝胶温度响应的体积相变

如图4（c）所示，水凝胶在20 ℃下为无色透明状，而在40 ℃下为乳白色，且体积明显收缩，表明水凝胶具有温度响应性。这是由于当温度低于水凝胶中共聚物的LCST 时，共聚物为亲水性，水凝胶的3D 网络结构可以容纳大量水分。当温度高于共聚物的LCST 时，共聚物分子链发生卷曲和塌陷，挤出部分水分，体积缩小[18]。水凝胶在上述两种状态下的SEM 照片如图4（d）所示，在20 ℃时水凝胶具有疏松多孔的3D 网状结构，而在40 ℃下转变为密集的小孔网状结构，说明水凝胶在40 ℃发生了体积收缩。图4（e）为水凝胶的体积收缩率随着温度的变化，水凝胶的体积收缩温度随着共聚物中AM 单元的增加而逐渐升高，但水凝胶的体积收缩率反而减小。这是因为随着AM 单元的逐渐增加，水凝胶的亲水性增强，使其体积相变温度升高，而水凝胶中共聚物链收缩能力减缓[18]。

图4 （a）水凝胶的溶胶-凝胶转变图；（b）P5 和ADH 混合体系的FT-IR 谱图；（c）水凝胶温度响应后的体积变化照片；（d）HG5在20 ℃和40 ℃下的SEM 照片；（e）水凝胶的体积收缩率Fig. 4 （a）Sol-gel transition images of hydrogels；（b）FT-IR spectra of P5 mixed with ADH; （c）Images of hydrogel volume change in response to temperature; （d）SEM images of HG5 at 20 ℃ and 40 ℃; （e）Volume shrinkage rate of hydrogels

2.6 自愈合性能

如图5（a）显示，在20 ℃下水凝胶在放置6 h 后，染料分子在样品间的切割表面发生了渗透，4 小块水凝胶融合为一体，且可承受自身重力而不分裂，说明水凝胶发生了自愈合。这是因为在响应温度以下，切口处的酰腙键之间发生了动态交换，使样品重新交联在一起。图5（b）显示，水凝胶在温度高于LCST 时不能发生自愈合。其原因是当温度高于共聚物LCST 时，水凝胶中共聚物的分子链发生卷曲和坍塌[18]，并包埋酰腙键，导致切口处的酰腙键很难发生动态交换。低于LCST 下水凝胶的自愈合能力如图5（c）所示，水凝胶HG5 在小应变（ε=1%）时保持稳定，G′高于G″；当大应变（ε=1 500%）施加到水凝胶上时，其网络结构被破坏，G′低于G″。去除大应变后，水凝胶又快速恢复到凝胶状态，说明水凝胶在低于LCST 时具有较好的自愈合能力。水凝胶模量随着测试时间增加略微增加，是由于水凝胶水分的蒸发导致固含量略微增加所致。

图5 （a）低于LCST（20 ℃）和（b）高于LCST（40 ℃）的自愈合图；（c）HG5 的动态模量变化Fig. 5 Self-healing images （a） below LCST（20 ℃） and （b） above LCST（40 ℃）; （c）Dynamic modulus changes of HG5

2.7 水凝胶的稳定性及药物释放能力

如图6（a）所示，当pH=2 时，在25 ℃下水凝胶的质量随着时间的增加而逐渐减小，且在12 h 内完全降解；而在38 ℃下水凝胶质量先减小然后趋于稳定，质量变化率约为80%。这是由于当pH=2 时，酰腙键发生断裂，水凝胶逐渐转变为溶胶，因此在25 ℃下的水凝胶被完全降解。在38 ℃下，水凝胶发生温度响应，失去部分水分。虽然部分酰腙键断裂，降解能够使水凝胶质量变小，但温度响应后共聚物链的塌陷包埋了部分酰腙键，避免了水凝胶被完全降解。当pH=7.4 时，酰腙键处于成键状态。25 ℃下水凝胶吸水溶胀，质量先增加70%，然后减少直至最后完全降解。这是因为水凝胶吸水溶胀后交联点很难维持其3D 网状结构而发生了降解[6]。在38 ℃下，水凝胶的质量缓慢减小，8 h 后不再变化，质量变化率为45%。这主要是因为在38 ℃下水凝胶会发生温度响应导致部分失水，但水凝胶外层发生相转变后内层水分不易扩散出来，使凝胶维持稳定。研究表明升高温度有利于提高水凝胶的稳定性。

图6 （a）HG5 的质量变化率随时间变化情况；（b）负载Dox 的HG5 的药物释放曲线Fig. 6 （a）Mass change ratio of HG5 with time ; （b）Dox release profiles of Dox-loaded HG5

水凝胶对模型药物Dox 的释放性能如图6（b）所示。在pH=7.4 的环境下，Dox 在38 ℃的释放速率比25 ℃下更快。虽然水凝胶在38 ℃表现出温度响应性，微观上呈致密网状结构（图4（d））；但是升高温度可以增强Dox 分子的热运动[13]，有利于药物Dox 的扩散释放。此外，在38 ℃下水凝胶表现出温敏性，其体积收缩导致Dox 随着凝胶中水分挤压而被释放，提高了释放速率。在pH=2 的环境下，25 ℃时Dox 释放很快，3 h 内完全释放，这是由于其快速降解所致。但在38 ℃下，Dox 的释放速率比25 ℃的释放速率小，45 h 才释放完全。这主要是因为在38 ℃下水凝胶会发生温度响应，有利于稳定水凝胶，降低释放速率。上述研究结果说明：在酸性环境下，升温可以提高药物Dox 的缓释性能。