聚乙烯醇/ε-聚赖氨酸水凝胶伤口敷料的制备及性能

2022-03-12梁文城王友长郎美东

功能高分子学报 2022年1期

范瑶，梁文城，王友长，郎美东

（华东理工大学材料科学与工程学院，上海 200237）

皮肤是人体最大的组织器官，容易受到外界伤害[1,2]。当皮肤受损时，需要伤口敷料构建一道抵御外界二次伤害的屏障[2]。理想的伤口敷料需要在创面提供潮湿的微环境，吸收伤口渗出液，允许气体交换，并且具有优异的抗菌活性[3,4]。纱布和棉花等传统伤口敷料易与组织黏连，不易移除且抗菌活性低[5]，因此已有许多新型伤口敷料（如海绵[6]、水凝胶[7]、薄膜等[8]）被研究，其中水凝胶与其他伤口敷料相比可维持伤口湿润，促进伤口坏死组织自溶性清创[9]，近年来在伤口敷料方面的应用备受关注。

聚乙烯醇（PVA）水凝胶由于具有良好的生物相容性、亲水性和生物降解性，已经在伤口敷料领域得到广泛研究和应用[10]。PVA 可以通过冻融法进行物理交联制备水凝胶[11]，但力学性能欠佳[10]。在PVA 的水凝胶网络中引入交联剂以进一步提升其力学性能[12]，然而常见的交联剂有一定的细胞毒性[13]。柠檬酸（CA）是一种无毒且可生物降解的绿色交联剂，在生物基水凝胶中得到了广泛应用[14,15]。

抗菌性能是伤口敷料的一项重要指标，因为细菌会引发严重的炎症，进而延缓伤口愈合，但PVA 水凝胶缺乏抗菌活性，极大限制了其在伤口敷料领域的应用[16]。通常采用化学接枝或者物理共混的方法引入抗菌剂，开发具有抗菌效果的改性PVA 水凝胶[9]。ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种天然多肽抗菌剂[17]，具有高水溶性、高热稳定性和低毒性[18-20]等优点，对真菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌等都具有显著抑制效果[21,22]，因此在食品防腐、药物递送、涂层材料[23,24]等领域广泛应用。虽然ε-PL 具有良好的抗菌活性，然而使用ε-PL 制备伤口敷料的研究较少。

本文以PVA 作为基体材料，向其中引入ε-PL 和CA，采用冻融法制备PVA 基复合水凝胶PVCL。系统研究了ε-PL 质量分数对复合水凝胶形貌、力学性能、热力学性能、结晶性能以及溶胀行为的影响。此外，分析PVCL 复合水凝胶的溶血行为，通过菌落计数法检测水凝胶对大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）的抗菌能力，采用CCK-8 法和活/死细胞染色法检测PVCL 复合水凝胶对间充质干细胞（MSCs）的细胞毒性，评估该复合水凝胶在伤口敷料领域的应用前景。研究表明ε-PL 可增强水凝胶的抗菌活性，CA 可以进一步提高水凝胶的力学性能。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

PVA：Mw=1.45×105，型号117，分析纯，上海迈瑞尔化学技术有限公司；ε-PL：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；CA：分析纯，上海阿拉丁试剂公司；蛋白胨和酵母粉：生化试剂，上海弘仁生物科技发展有限公司；琼脂：生化试剂，北京博立生物科技有限公司；E.coli（型号BNCC 336 953）、S.aureus（型号BNCC 340 652）：生化试剂，北京北纳创联生物技术有限公司。

1.2 表征

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）仪：美国Thermo Scientific 公司Nicolet 6 700 型，热涂法，波长范围400～4 000 cm−1；扫描电子显微镜（SEM）：日本日立公司S-3400N 型；万能拉伸试验机：美国BOSE 公司Load Frame 3 200 System 型，拉伸速率为10 mm/min；差示扫描量热（DSC）：美国PerkinElmer 公司DSC8500 型，N2氛围，升温速率为10 ℃/min，升温区间为25～250 ℃，结晶度χc=ΔHm/（w×ΔH0）×100%，其中ΔHm是样品的熔化热，w是PVA 的质量分数，ΔH0是结晶度为100% PVA 的熔化热（138.6 J/g）；多功能酶标仪：美国Molecular Devices 公司SpectraMax M2 型。

1.3 PVCL 的制备

首先，称取一定量的PVA 于去离子水中，在95 ℃搅拌4 h 至PVA 溶解，得到透明溶液。然后，配制w=15%的PVA 水溶液，加入CA（水溶液质量的3%）和ε-PL（分别为水溶液质量的0、1%、3%、5%、7%）在一定温度下搅拌24 h，制备均匀混合的溶液。最后，将混合后的溶液超声30 min 消泡，气泡除尽后倒入塑料培养皿模具中，放入冰箱，在−20 ℃冷冻48 h，于室温自然解冻，冷冻-解冻过程循环3 次制备出复合水凝胶，分别标记为PVCL-0、PVCL-1、PVCL-3、PVCL-5、PVCL-7，其制备过程如图1 所示。

图1 PVCL 的制备过程Fig. 1 Preparation process of PVCL

1.4 性能测试

1.4.1 水凝胶的溶胀率将干燥后的水凝胶（质量为m0）在37 ℃的磷酸缓冲盐（PBS）溶液中浸泡24 h，然后从PBS 溶液中移出（质量为m1），用滤纸将表面多余的水分去除。水凝胶的溶胀率（SR）计算公式如下：

1.4.2 水凝胶的抗菌实验将水凝胶与E.coli和S.aureus在培养基中共培养6 h，然后梯度稀释，接着取20 μL稀释后的细菌悬液涂布于琼脂平板中，将琼脂平板放在生化培养箱中培养24 h；最后根据平板上的菌落数计算抗菌率（AR），计算公式如下：

其中：Nc和Ns分别为对照组和抗菌处理组琼脂平板上的菌落数量，以PVA 水凝胶作为对照组。

1.4.3 水凝胶的溶血率使用抗凝兔血测定水凝胶的溶血率。将红细胞使用PBS 溶液稀释25 倍后与水凝胶在37 ℃下共培养1 h。将红细胞悬液分别与PBS 溶液和去离子水共培养，作为阴性对照组和阳性对照组。共培养后的红细胞悬液用离心机在1 500 r/min 的条件下离心10 min，用酶标仪测定上清液在545 nm 处的吸光度（OD）。溶血率（HR）的计算公式如下：

其中：ODsample、ODpositive和ODnegative分别对应水凝胶、阳性对照组和阴性对照组上清液的吸光度。

1.4.4 水凝胶的细胞毒性采用CCK-8 法检测水凝胶对MSCs 的细胞毒性。将灭菌后的水凝胶置于达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）溶液中浸泡48 h 制备浸提液。将MSCs 接种于48 孔板中（每孔1×104个细胞），与浸提液在CO2体积分数为5%的生化培养箱中共培养24 h，温度为37 ℃。其中MSCs 与PVA 水凝胶浸提液共培养作为对照组。最后，用酶标仪测定CCK-8 染色细胞悬液在450 nm 处的OD 值。与水凝胶浸提液共培养后的细胞存活率（CV）为对应样品组和对照组的吸光度比值。

采用活/死染色法测定24 孔板上间充质干细胞的细胞形态。制备水凝胶浸提液，将MSCs 接种于24 孔板（每孔1.0×104个细胞），与浸提液在生化培养箱中共培养24 h。其中MSCs 与PVA 水凝胶浸提液共培养作对照组。钙黄绿素-AM/碘化丙啶混合物与细胞共培养30 min，然后用PBS 溶液洗涤3 次，使用激光共聚焦显微镜（Leica Microsystem）观察细胞形态。

2 结果与讨论

2.1 水凝胶的红外光谱图

图2 是水凝胶样品的红外光谱图。PVA 在3 300～3 500 cm−1处的宽峰为-OH 的伸缩振动峰，2 929 cm−1和2 851 cm−1处出现的峰为-CH2的伸缩振动峰，1 632、1 378 cm−1和1 093 cm−1处分别为-OH 的弯曲振动峰、-CH 的弯曲振动峰和-C-O 的伸缩振动峰[25]。PVCL-0 在1 710 cm−1处出现了新峰，为CA 中羧基的特征峰。引入ε-PL 后，在3 300～3 500 cm−1处为-OH 和-NH2的重叠峰，且峰形变得宽而钝。与PVCL-0 相比，引入ε-PL 后的水凝胶在1 587 cm−1处出现了-NH 的伸缩振动峰，1 270 cm−1处的峰为C-N 伸缩振动峰，表明成功制备了PVCL 复合水凝胶。

图2 水凝胶的FT-IR 谱图Fig. 2 FT-IR spectra of hydrogels

2.2 水凝胶的形貌分析

水凝胶的表面形貌如图3 所示。由图3 可知，所有水凝胶样品均呈现相互连接的孔状结构。这是由于使用冻融法制备PVA 基水凝胶，大多数水在冷冻过程中形成了冰晶，当水凝胶解冻时，这些冰晶融化并形成多孔结构。PVA 水凝胶的表面粗糙，孔结构致密（图3（a）），在加入CA 后，表面变得更加致密（图3（b）），而在引入ε-PL 后，水凝胶表面的孔洞逐渐增多，显示出多孔互连的微观结构（图3（c）～3（f）），这样的结构允许气体交换，可以吸收伤口渗出液，并且潮湿的微环境有利于伤口愈合。

图3 水凝胶的扫描电镜图Fig. 3 SEM images of hydrogels

2.3 水凝胶的力学性能

水凝胶的力学性能如图4 所示。纯PVA 水凝胶的拉伸强度为1.8 MPa，PVCL-0 的拉伸强度为3.0 MPa，提高了66.7%；断裂伸长率由355.9%增加到426.5%，提高了19.8%。这是因为加入CA 后，CA 与PVA 之间的氢键形成交联网络，并且小分子CA 可以作为增塑剂提高PVCL-0 水凝胶的拉伸强度和断裂生长率。加入ε-PL 后，随着ε-PL 含量的增大，拉伸强度和断裂伸长率均呈现先小幅增加后逐渐下降的趋势，这是由于随着ε-PL 的加入，ε-PL 的-NH2和PVA 的-OH 基团之间形成氢键，但是随着ε-PL 含量的增加，PVA 之间的距离增大，破坏了PVA 分子间氢键的作用力，导致拉伸强度和断裂伸长率均呈现一定程度的下降。

图4 水凝胶的力学性能Fig. 4 Mechanical properties of hydrogels

2.4 水凝胶的热性能

水凝胶的DSC 分析结果如表1 所示。PVCL-0的结晶度为46.1%，明显高于PVA 的41.4%，这是由于PVA 与CA 之间形成氢键导致熔融温度升高。随着ε-PL 含量的增加，结晶度也呈现先增大再下降的趋势，这是由于少量的ε-PL 可以与PVA 之间形成氢键，促使熔融温度有一定升高，此外，ε-PL 含量增加导致PVA 之间间距增大，交联减少，熔融温度降低，结晶度降低。

表1 水凝胶的DSC 分析结果Table 1 DSC analysis results of hydrogels

2.5 水凝胶的溶胀率

水凝胶的溶胀率如图5 所示。PVA 的溶胀率为245.2%，加入CA 后，PVCL-0 的溶胀率降低为235.3%，这是因为PVCL-0 结晶度较高，对溶胀率有抑制作用。随着ε-PL 的含量增加，交联网络的密度降低，溶胀率逐渐增加。PVCL-7 的溶胀率最大，为293.7%。因此以PVA 为基体的水凝胶是水溶胀型聚合物，可以吸收伤口渗出液，促进伤口愈合。

图5 水凝胶的溶胀率Fig. 5 Swelling rates of hydrogels

2.6 水凝胶的抗菌活性

从水凝胶的抗菌效果图（图6（a））可知，PVA 板的菌落数量较多，随着ε-PL 含量的增加，琼脂板上的细菌菌落数量逐渐减少，PVCL-5 和PVCL-7 平板上基本没有观察到细菌的生长。使用菌落计数法测定水凝胶伤口敷料对E.coli和S.aureus的抗菌率（图6（b）），以PVA 水凝胶作为对照组，随着ε-PL 含量的增加，抗菌活性进一步提升，PVCL-5 和PVCL-7 对E.coli和S.aureus的抗菌率均接近100%。这是由于ε-PL 是一种阳离子多肽，与细菌的细胞膜接触可以增加细胞膜的通透性，并进一步导致细胞质泄露，进而杀死细菌。因此，添加ε-PL 可以增强PVCL 水凝胶的抗菌能力。

图6 水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的（a）抗菌效果图和（b）抗菌率Fig. 6 （a）Antibacterial effect and （b） antibacterial rate of hydrogel against E.coli and S.aureus

2.7 水凝胶的溶血率

图7（a）为水凝胶溶血效果图，与阳性对照组相比，PVCL 复合水凝胶上清液均无色透明，无溶血现象。水凝胶溶血率如图7（b）所示，复合水凝胶的溶血率随着ε-PL 含量的增加而增加，PVCL-7 溶血率最高，为1.4%。这是由于ε-PL 为阳离子多肽，阳离子增多会破坏红细胞的细胞膜，导致溶血率增大。根据国际标准化组织10993-4 规定，溶血率小于5%即可认为具有良好的血液相容性。因此，PVCL 水凝胶满足伤口敷料的要求，具有较好的血液相容性。

图7 水凝胶的（a）溶血效果图和（b）溶血率Fig. 7 （a） Hemolysis effect and （b） hemolysis rates of hydrogels

2.8 水凝胶的细胞毒性

MSCs 的细胞存活率如图8（a）所示。与对照组PVA 相比，PVCL 水凝胶的细胞存活率均大于89%，随着ε-PL 含量的增加，细胞存活率逐渐降低，表明ε-PL 含量增加会导致阳离子含量增加，进而破坏细胞膜，导致细胞死亡。

活/死细胞染色实验结果如图8（b）所示。活细胞发出绿色荧光，死细胞发出红色荧光。由图8（b）可以看出，所有组的细胞呈纺锤状，大多数细胞呈现绿色荧光，PVCL-5 和PVCL-7 组可以观察到极少数红色荧光，表明随着ε-PL 含量的增加，细胞毒性增大。图8 表明，通过调节ε-PL 的含量可控制细胞毒性。