血液肿瘤患儿MTHFR和ABCB1基因多态性与甲氨蝶呤骨髓抑制的相关性

马 乐,吕冬梅,韩 佳*

0 引言

血液系统恶性肿瘤的发病率和死亡率在儿童疾病中位居前列，化疗时由于儿童生理机能尚未成熟，对大剂量药物的耐受性较差，常因诸多毒副作用影响疾病的治疗。大剂量甲氨蝶呤(High-dose methotrexate，HD-MTX)是儿童血液肿瘤治疗的一线药物，能够通过竞争性抑制二氢叶酸还原酶的活性抑制肿瘤细胞的增殖，显著提高癌症患者的长期生存率[1-2]。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)可以抑制几乎所有分裂增殖比高的细胞，不良反应发生率较高，其中骨髓抑制较为常见。骨髓抑制又称血液学毒性，一般发生于化疗后的第5～7天[3]，主要表现为白细胞、血小板、中性粒细胞及血红蛋白减少，严重者易并发全身感染，影响化疗周期甚至致死。患者对MTX血液学毒性反应的发生率和严重程度往往存在较大的个体差异，随着药物基因组学的发展，研究者发现，药物代谢酶与转运体基因位点的杂合与纯合突变均可能引起编码的酶失活或者活性增强，进而引起不良反应的个体差异。有研究报道，这种个体差异与亚甲基四氢叶酸还原酶 (Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)和ATP结合盒B亚家族成员1转运蛋白(Adenosine triphosphate-binding cassette，subfamily B，member 1 gene，ABCB1)基因多态性之间可能存在关联性[4-7]。MTHFR能够参与叶酸代谢、DNA的合成和甲基化，与MTX药理作用的发挥密切相关。编码MTHFR的基因发生不同种类的突变可能导致氨基酸功能的改变，使DNA的合成和修复受到影响。目前关于MTHFR的不同单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)与药物代谢相关性研究最多的位点是MTHFR C677T。当MTHFR第677位密码子发生了C(胞嘧啶)/T(胸腺嘧啶)突变时，其酶活性发生改变，继而使叶酸的正常功能受到影响，MTX的药效和不良反应也可能发生改变[8-9]。ABCB1又称多药耐药基因(Multidrug resistance-1，MDR1)，能够编码介导内源性物质和药物的向外释放的P-糖蛋白，P-糖蛋白与疏水性化疗药物有结合作用，并能够借助ATP以主动转运的方式将药物泵出细胞。有报道ABCB1 C3435T是最可能与P-糖蛋白的表达与功能有关的位点(ABCB1 C3435T)[10]。ABCB1 C3435T的3种亚型编码的P-糖蛋白呈不同的表达状态时，可能引起药物疗效和毒性的差异[11]。因此，本研究探讨血液肿瘤患儿应用HD-MTX化疗后骨髓抑制与MTHFR C677T(rs1801133)和ABCB1 C3435T(rs1045642)基因多态性的相关性，从基因水平判断化疗后的骨髓抑制程度，为治疗提供有意义的参考，从而提高患儿的生存质量。

1 资料和方法

1.1 研究对象 纳入2019-2020年在徐州医科大学附属医院住院且应用HD-MTX (>500 mg/m2)治疗的血液系统恶性肿瘤患儿共94例，本研究经医院伦理委员会批准，患儿监护人知情同意。

入选标准：①1～17岁;②确诊为血液系统恶性肿瘤(包括急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等)；③采用大剂量甲氨蝶呤注射液治疗，且化疗中未出现严重过敏反应；④使用HD-MTX前及用药后给予充分水化及碱化尿液。排除标准：①化疗前查血常规及肝肾功能，生化指标在正常范围内；②治疗方案中合并使用其他可引起骨髓抑制的药物。收集并整理患者的基本信息、给药剂量、合并用药情况、MTX血药浓度以及用药期间产生的不良反应等。

1.2 方法

1.2.1 给药剂量与方法 MTX总剂量为2～5 g/m2，将给药量的1/10(不超过500 mg)作为突击量于30 min内快速静脉滴入，余量在23.5 h内匀速滴入。MTX治疗前、治疗后3 d口服碳酸氢钠，碱化尿液使尿液pH≥7。滴注MTX当日以及其后3 d给予患儿充分水化，用酶放大免疫法在用药后24 h、48 h、72 h分别测定MTX血药浓度。于滴注MTX 后42 h静注15 mg/m2的亚叶酸钙解救，每6小时1次，密切观察患儿反应，根据MTX血药浓度调整次数及剂量，至浓度≤0.1 μmol/L。

1.2.2 基因型检测方法 使用核酸提取及纯化试剂(上海百傲科技有限公司)从患者全血中提取DNA，置于-20 ℃冰箱内保存。使用PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程有限公司)配制50 μl的扩增体系置于PCR仪(美国应用生物系统公司)内完成扩增。引物(由上海生工合成)序列见表1。PCR扩增程序：MTHFR C677T(rs1801133)：①预变性95 ℃，5 min。②30个循环，变性95 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，40 s。③终延伸72 ℃，7 min，结束后于4 ℃保存。ABCB1 C3435T(rs1045642)：①预变性95 ℃，5 min。②30个循环，变性95 ℃，30 s；退火57.1 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s。③终延伸72 ℃，5 min，于4 ℃保存。扩增结束后用2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行特异性验证。剩余PCR产物原液送至上海生工测序，将测序结果用CHOMAS软件与MTHFR和ABCB1基因SNP位点的标准序列比照，以确定患者基因型。

表1 MTHFR与ABCB1基因PCR引物信息

1.2.3 骨髓抑制评价标准 化疗过程的毒性反应判定参照世界卫生组织推荐的化疗药物毒副反应分级标准，将骨髓抑制(血液学毒性)分为0级、Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级与Ⅳ级，见表2。因Ⅲ级和Ⅳ级毒性反应可对临床治疗产生直接影响，故将Ⅲ级以上骨髓抑制与基因分型结果进行分析。

表2 化疗后骨髓抑制分级标准

2 结果

2.1 一般资料 本研究纳入94例患儿，男55例，女39例，年龄1～17岁，平均年龄为(7.42±4.27)岁，体重(27.08±12.92)kg，BMI为(16.97±3.14)kg/m2。

2.2 基因型与骨髓抑制程度的分布 采用PCR-直接测序法测定MTHFR C677T与ABCB1 C3435T位点基因型，如图1和图2所示，箭头所指为变异碱基。94例患儿中，MTHFR C677T位点CC型患儿25例(26.60%)，CT型42例(44.68%)，TT型27例(28.72%)；ABCB1 C3435T位点CC型患儿43例(45.74%)，CT型34例(36.17%)，TT型17例(18.09%)。化疗后，患儿出现Ⅰ级骨髓抑制11例(11.70%)，Ⅱ级38例(40.43%)，Ⅲ级31例(32.98%)，Ⅳ级14例(14.89%)，共有45例(47.87%)患儿发生Ⅲ级以上骨髓抑制，各位点基因型与骨髓抑制严重程度的分布情况见表3。

图1 MTHFR C677T位点基因分型波形图

图2 ABCB1 C3435T位点分型波形图

表3 基因型与骨髓抑制程度的分布[例(%)]

2.3 基因多态性与MTX骨髓抑制的相关性 将患者按骨髓抑制严重程度分级分为轻度组(0～Ⅱ级)和严重组(Ⅲ级以上)。在MTHFR C677T位点和ABCB1 C3435T位点中，均是CC型为野生纯合型，CT型为突变杂合型，TT型为突变纯合型。两位点的纯合子CC型携带者发生MTX化疗后，严重骨髓抑制的比率均低于其他亚型；MTHFR C677T CT型患儿发生Ⅲ级以上骨髓抑制的风险是CC型的3.125倍(95%CI：1.102～8.859，P=0.029)，该位点野生型携带者发生MTX严重骨髓抑制的比率低于突变杂合型，且差异具有统计学意义(P<0.05)；ABCB1 C3435T TT型患儿发生Ⅲ级以上骨髓抑制的风险是CC型的3.422倍(95%CI：1.056～11.092，P=0.036)，ABCB1 C3435T位点含有T等位基因的(CT+TT)患儿发生Ⅲ级以上骨髓抑制的风险是CC型的2.667倍(95%CI：1.152～6.117 2，P=0.021)，该位点野生型携带者发生MTX严重骨髓抑制的比率显著低于突变纯合型和至少携带1个T等位基因的患儿(P<0.05)，见表4。

表4 基因多态性与MTX骨髓抑制的相关性[例(%)]

3 讨论

MTX是一种抗叶酸类抗肿瘤药，在HD-MTX临床应用于血液肿瘤的过程中，由于药物选择性较差，患者化疗后常会出现不同程度的不良反应，导致用药剂量减少或治疗停止[12]。随着遗传药理学的进展，大量研究显示，基因多态性可能是导致药物疗效和不良反应个体差异的相关因素之一。

MTHFR是参与DNA合成和甲基化的一个重要的限速酶，影响核酸代谢过程，MTX的药物反应与MTHFR催化还原的5,10-亚甲基四氢叶酸的浓度正相关。有Meta分析结果显示，MTHFR C677T位点T等位基因增加了患者发生MTX骨髓抑制的风险，该位点与MTX的血液学毒性相关[13-14]。有报道显示，在发生Ⅲ级以上骨髓抑制的骨肉瘤患者中，TT型的频率显著高于CT型和CC型[15]。李静等[16]对98例接受HD-MTX化疗的急性淋巴细胞白血病患者的研究显示，MTHFR C677T各基因型间Ⅱ级以上骨髓抑制的发生率差异有统计学意义。Choi等[17]的研究显示，MTHFR C677T可能成为与MTX相关骨髓抑制的独立预测指标，与Eissa等[18]的研究结果一致。另有一项关于74例急性淋巴细胞白血病患儿的研究报道，MTHFR C677T 位点TT基因型与MTX血液学毒性显著相关[19]。本文的研究结果显示，MTHFR C677T位点为CT型的患者发生Ⅲ级以上骨髓抑制的比率显著高于CC型，可能对MTX化疗后骨髓抑制存在一定程度的预测价值。

ABCB1主要位于细胞膜上，可以以主动转运的形式将药物泵出细胞，降低胞内药物浓度并减轻药物对细胞的毒性作用。由ABCB1编码的P-糖蛋白能够影响药物在机体内的吸收、分布和排泄。有报道ABCB1 C3435T不同基因型患者细胞中P-糖蛋白活性的差异可能对使用P-糖蛋白运输的抗癌药物的化疗反应产生影响[20]。杨琳等[21]纳入81例使用HD-MTX化疗的非霍奇金淋巴瘤患者的研究中，至少含1个T等位基因(CT+TT)患者发生2级以上血小板减少的比率显著高于CC患者，与潘骋[22]的结果一致。另有一项针对墨西哥急性淋巴细胞白血病患儿的研究显示，该位点CC纯合型携带者发生白细胞减少的风险更低[23]。本研究中，随着ABCB1 C3435T位点的基因型含等位基因T的数量上升，发生Ⅲ级以上骨髓抑制的比率也逐步上升，CC型患儿发生严重骨髓抑制的比率显著低于 (CT+TT)型的患儿，和上述研究结果相同。

综上所述，检测MTHFR C677T和ABCB1 C3435T位点基因型对预测MTX相关骨髓抑制程度可能有潜在的临床价值。此外，目前关于药物代谢酶和转运体基因多态性对MTX疗效与毒性影响的研究几乎都仅限于固定的某一种族和疾病，而治疗方案和患者群体等方面的变化都可能会影响基因多态性与治疗结果间的关系[24-25]。因此，在未来的研究中仍需要大规模和多中心的实验，基因多态性对骨髓抑制严重程度的具体影响机制也有待进一步探索，为依据药物基因组学设计个体化给药方案、减少患者严重不良反应奠定基础。