刺五加对颈性眩晕患者多巴胺D2受体基因CpG岛甲基化及体外小胶质细胞的M1/M2极性的影响

郝 军，常虎飞，盛 旻，杨春艳，邢娟丽

0 引言

颈性眩晕(Cervical vertigo，CV)指因颈椎部位组织结构障碍而引起的眩晕，占眩晕的65%[1]。近年来，CV的发生率明显升高，而且呈现年轻化发展[2]，其诊断和治疗仍有明显难度，需要深入研究CV的发病机制并探究良好的治疗策略[3]。

多种中药在CV治疗中表现出良好的效果[4]，其中刘俊逸[5]应用刺五加(Acanthopanax senticosus)注射液改善了CV患者的神经压迫，促进了血液循环以及脑部供血，治疗有效率达到93.3%，然而，刺五加缓解或治疗CV的内在机制仍不清楚。研究表明，刺五加通过调节多巴胺D2受体(Dopamine Receptor D2，DRD2)和小胶质细胞M1(促炎)/M2(抗炎)极性类型对血管收缩/舒张和神经损伤发挥改善作用，并对机体具有镇痛效果[6-8]。然而，刺五加治疗对CV患者体内DRD2表达以及小胶质细胞的M1/M2极性的影响仍不清楚。本研究纳入经刺五加注射液症状缓解的CV患者和未进行治疗的CV患者，检测血液中DRD2的表达和DRD2基因CpG岛甲基化改变，并在体外培养人小胶质细胞hmc-3，探讨刺五加注射液对其M1/M2极性的调节作用。

1 资料与方法

1.1 基本资料 纳入我院30例确诊的CV患者(CV组，未行刺五加治疗)以及同期经过刺五加治疗后临床疗效评级为显效的30例CV患者(治疗组)，此外，招募30例健康对照受试者(健康组)。

CV组纳入标准：①主诉眩晕；②经影像学检验并经2位医生诊断为椎动脉颈椎病；③三磷腺苷、10%葡萄糖注射液、维生素B6、辅酶A 100 U进行常规治疗[5]。治疗组纳入标准：①与CV组纳入标准一致；②以三磷腺苷、10%葡萄糖注射液、维生素B6、辅酶A 100 U治疗，刺五加注射液50 ml静脉滴注1个疗程；③临床治疗效果评为显效，即患者感觉不到有眩晕的症状。

排除标准：①既往精神病史和药物治疗；②有血缘关系的患者；③非颈椎结果异常的其他因素引起的眩晕患者。

1.2 方法

1.2.1 试剂与耗材 人小胶质细胞hmc-3购于武汉普诺赛生命科技有限公司；EDTA管购于上海新睿生物科技有限公司；QIAcube全自动核酸纯化系统全自动核酸提取工作站购于德国QIAcube公司；EpiTect Plus DNA亚硫酸氢盐试剂盒购于美国Qiagen公司；PyroMark Q24 Advanced试剂盒购于上海研卉生物科技有限公司。细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit 8,CCK-8)购于上海碧云天公司。酶标仪FC购于美国赛默飞世尔公司。RNA提取试剂盒、Power SYBR Green及高容量cDNA反转录试剂盒均购于大连Takara公司。RIPA蛋白提取试剂盒购于美国Sigma-Aldrich公司。DRD2、CD16、CD32、CD86、Arginase1、CD206、GAPDH的第一抗体均购于美国Abcam公司。Alexa染料购于美国Invitrogen公司。DAPI购于美国Life Technologies公司。AmpliTaq gold试剂盒购于美国赛默飞公司。

1.2.2 血样收集 采用EDTA管收集静脉血。从全外周血白细胞中提取基因组DNA。根据制造商的协议，使用QIAcube全自动核酸纯化系统全自动核酸提取工作站提取基因组DNA。于4 ℃保存纯化的基因组DNA。

1.2.3 RT-qPCR 使用总RNA提取试剂盒抽提外周血总RNA或者小胶质细胞的总RNA。使用高容量cDNA反转录试剂盒，用随机引物合成第一链cDNA，随后使用Power SYBR Green在CFX96-Bio Rad实时PCR检测系统上进行qPCR。使用GAPDH作为内参基因。基因引物如表1。

表1 RT-qPCR引物序列

亚硫酸氢盐转换：根据生产商的说明严格使用EpiTect Plus DNA亚硫酸氢盐试剂盒对基因组DNA(各1 000 ng)进行亚硫酸氢盐转换。并按照试剂盒的协议对转换后的基因组DNA进行纯化。

1.2.4 PCR扩增与甲基化率检测 PCR扩增：检测的CpG-1至CpG-7位点的甲基化[9]，对CpG位点进行扩增。每个PCR样品的最终反应体积为40 μl，每个反应均包含3.5 μl亚硫酸氢盐-修饰的全基因组DNA、0.2 mM dNTPs、10×PCR缓冲液、0.5 U的AmpliTaq gold，以及0.2 μM正向和反向引物。循环条件：变性10 min，45个变性循环，95 ℃下变性30 s，60 ℃下退火30 s，在72 ℃下延伸1 min，最后在72 ℃延伸 10 min。

甲基化率检测：分析7个CpG位点的甲基化率。使用PyroMark Q24 Advanced试剂盒对PCR产物进行测序。测序引物：5′-AGTTTTTAAAGGAGAAGATT-3′(CpG-1至CpG-7)，从而分析每个CpG甲基化率。随后，使用PyroMark Q24 Advanced软件对各组甲基化率进行定量。

1.2.5 小胶质细胞培养 使用DMEM/F12培养基小胶质细胞hmc-3，DMEM/F12中补充10%FBS和L-谷氨酰胺。培养于含5%CO2的37 ℃培养箱中，细胞2 d换液1次。使用刺五加注射液处理小胶质细胞。分别使用20 μg、40 μg、80 μg的刺五加注射液处理细胞24 h[10]。收集细胞并进行后续实验。

1.2.6 CCK-8实验 使用CCK-8测定hmc-3细胞存活率，严格按照生产商提供的说明书，使用酶标仪FC在450 nm处测定细胞存活率。

1.2.7 蛋白质印迹 用RIPA缓冲液提取细胞总蛋白，并用BCA测定法进行定量。蛋白经过SDS-PAGE电泳分离并使用NC膜进行转印，对膜使用一抗孵育过夜，随后使用二抗孵育4 h。使用化学发光法对膜进行显色。使用Image Lab软件通过光密度测定法定量蛋白条带灰度强度。实验重复3次。

1.2.8 细胞免疫荧光 免疫荧光标记细胞中DRD2蛋白的表达，将小胶质细胞用4%多聚甲醛固定10 min，使用封闭液(50 mmol/L Tris缓冲液，含20%驴血清和0.3%Triton-X)孵育1 h。将DRD2一抗(1∶300)在4 ℃下孵育过夜：洗涤切片并在室温下与绿色荧光Alexa染料偶联的二抗孵育4 h。在Tris缓冲盐水中洗涤并用DAPI对细胞核进行复染后，将盖玻片装在载玻片上。使用共焦激光显微镜获取图像。使用ImageJ软件对共聚焦图像DRD2阳性细胞进行定量分析。

1.3 统计学分析 使用SPSS 22.0软件进行统计分析，并使用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验。甲基化率遵循正态分布。用单因素方差分析比较健康组、CV组和治疗组DRD2的表达、DRD2每个CpG的甲基化率，并检测对照组和刺五加组小胶质细胞的DRD2表达和M1/M2表型变化。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 刺五加治疗对CV患者DRD2基因表达的影响 首先检测CV组和健康组外周血中DRD2基因的mRNA表达水平，结果如图1显示，与健康组比较，CV组的DRD2 mRNA表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)。与CV组比较，治疗组外周血中DRD2基因的mRNA表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 刺五加对CV患者体内DRD2基因mRNA水平的影响

2.2 刺五加治疗对CV患者DRD2基因甲基化率的影响 图2A显示所分析的DRD2启动子区域的位置。甲基化比较结果如图2B，检测30个CV组样本和30个健康组样本中DRD2基因的7个CpG位点的甲基化率，其中CpG-2(14.1±2.6vs.12.6±2.7，P=0.001)，CpG-4 (27.6±4.1vs.25.4±4.2，P=0.003)，CpG-5 (8.6±1.9vs.7.9±1.7，P=0.002)，CpG-6 (11.2±1.8vs.10.0±2.4，P=0.001)，CpG-7 (12.1±2.3vs.11.4± 3.0，P=0.002)。CV组的CpG-1～CpG-7的甲基化率平均值(14.2±1.9)均高于健康组(13.3±2.2)，差异均有统计学意义(P=0.001)。如图2C所示，刺五加治疗对DRD2基因甲基化有影响，治疗组的CpG-1～CpG-7的甲基化率(12.5±1.5)平均值低于CV组(14.7±1.8)，差异有统计学意义(P=0.001)。

图2 刺五加对DRD2基因不同CpG位点甲基化率的影响

2.3 刺五加对小胶质细胞增殖率的影响 刺五加注射液体外处理小胶质细胞，观察刺五加对小胶质细胞增殖率的影响。如图3，与对照组比较，20 μg刺五加组的增殖率变化差异无统计学意义(P>0.05)。40 μg刺五加组小胶质细胞增殖率升高，差异有统计学意义(P=0.041)。80 μg刺五加组增殖率升高，差异有统计学意义(P=0.016)。

图3 通过CCK-8实验检测不同浓度的刺五加注射液对小胶质细胞hmc-3增殖率的影响

2.4 刺五加对小胶质细胞DRD2基因表达的影响 见图4A、4B。与对照组比较，20 μg刺五加组中DRD2基因的mRNA水平和蛋白表达水平变化差异无统计学意义(P>0.05)。40 μg刺五加组中DRD2基因的mRNA水平和蛋白表达水平上调，差异有统计学意义(P=0.034)。80 μg刺五加组中DRD2基因的mRNA水平和蛋白表达水平上调，差异有统计学意义(P=0.016)。如图4C，使用免疫荧光法检测DRD2在小胶质细胞中的表达，结果与蛋白免疫印迹法一致。由于80 μg刺五加对小胶质细胞的增殖率和DRD2有明显的增加作用，因此选择80 μg进行后续研究。

图4 RT-qPCR、蛋白免疫印迹实验及细胞免疫荧光法分别检测刺五加注射液对小胶质细胞DRD2 mRNA(A)和蛋白水平(B/C)的影响

2.5 刺五加对小胶质细胞DRD2甲基化率的影响 在小胶质细胞中，刺五加组的CpG-1至CpG-7的甲基化率(12.63±3.8)低于对照组(14.69±2.8)，差异均有统计学意义(P<0.001)，见图5。

图5 刺五加对小胶质细胞中DRD2基因不同CpG位点甲基化率的影响

2.6 刺五加对小胶质细胞M1/M2极性的影响 使用RT-qPCR检测对照组和刺五加组中M1表型CD16、CD32、CD86和M2表型Arginase 1、CD206的mRNA水平。结果显示，与对照组比较，刺五加组中M1表型CD16、CD32、CD86的表达下调，差异均有统计学意义(P<0.001)，而Arginase 1、CD206的mRNA表达上调，差异均有统计学意义(P<0.001)，见图6A。

图6 刺五加对小胶质细胞M1/M2极化标志物的mRNA(A)和蛋白(B)水平的影响

使用蛋白免疫印迹法检测小胶质细胞M1/M2极化标志物的蛋白水平，其中与对照组比较，CD16、CD32、CD86的表达下调，而Arginase1、CD206表达上调，差异均有统计学意义(P<0.001)，见图6C。

3 讨论

本研究以CV患者的临床血液样本为基础，通过检测刺五加对体内DRD2甲基化率变化以及刺五加对小胶质细胞的极性影响，探讨了刺五加对CV治疗的内在机制。本研究结果表明，刺五加可能通过抑制CV患者DRD2的CpG位点甲基化促进DRD2表达，此外,刺五加可以正向调节小胶质细胞的M2型极化特征，为探明刺五加治疗CV疾病的内在机制提供部分证据。

CV是一种源于颈椎病变引起脑供血不足导致的头晕、头痛、颈部疼痛为特征的疾病[11]。近年来，CV的发病率持续升高，发病人群明显趋向于青年，对患者的生活质量造成严重影响[12]，然而,CV存在误诊率高，且缺乏有效的诊断和治疗策略。目前存在4种假说从不同方面解释CV，包括本体感受性颈性眩晕、Barré-Lieou综合征、椎动脉旋转性眩晕、偏头痛相关性CV[13]。机制研究表明，颈椎退变是导致颈部结构改变的关键因素，并引起颈部神经压迫、颈性疼痛合并肌张力障碍[13]。临床研究报道，刺五加注射液对CV的临床症状具有缓解作用，主要是通过放松过度紧张的颈部肌肉、通过颈神经减压、改善血液循环、缓解疼痛等方式从而达到缓解症状的作用[5]。本研究中纳入的30例刺五加治疗后疗效为显效的患者，其体内DRD2基因CpG位点甲基化和表达有改变，并且我们在体外水平同样验证了刺五加对DRD2甲基化和表达的影响，这表明DRD2甲基化可能是刺五加调节CV的机制之一。

研究表明，刺五加提取物通过调节帕金森病小鼠的多巴胺受体从而发挥神经保护作用[6]。多巴胺是内源性儿茶酚胺类物质，直接通过调节多巴胺受体调控血管的收缩[14]。DRD2与脑、肾、肠系膜血管的舒张均有关[15]。研究表明，DRD2在肌张力异常及神经损伤导致的疼痛中发挥重要作用[16]。而且在偏头痛的研究中同样发现偏头痛患者的DRD2存在高度敏感性。既往对DRD2与炎性疼痛和神经病理性疼痛的研究较多。Del Zompo等[17]研究表明，DRD2在不同类型的偏头痛中的表达模式不同，甚至具有保护作用[18]。表观遗传学改变是提高疾病诊断效率的关键，本研究纳入经刺五加注射液治疗后显效的CV患者和未进行治疗的CV患者，检测了血液中DRD2的表达和甲基化改变，从体内和体外均观察到刺五加对DRD2 CpG位点甲基化的负调节和对表达的正向调节。我们在体外通过免疫荧光法直接观察到80 μg刺五加上调DRD2表达的结果。因此，以上证据均支持刺五加可能通过对DRD2的甲基化和表达的调节从而改善CV症状。以上研究表明，DRD2的表观遗传学检测是CV诊断和治疗的潜在标志物。

刺五加是我国东北地区常见的传统草药，常用于治疗神经退行性疾病，如脑缺血和抑郁[19]。已证实刺五加通过调节小胶质细胞的活化发挥对神经的保护作用[7]。促炎(M1)表型和抗炎(M2)表型是小胶质细胞活化的2种不同表型[20]，根据研究，刺五加通过调节巨噬细胞的CD163、CD11b、CD80、CD64，从而促进巨噬细胞向M2型极化发展[21]。本研究数据也显示刺五加下调小胶质细胞的M1表型CD16、CD32、CD86，但上调M2表型Arginase 1、CD206的mRNA和蛋白水平。这表明刺五加可能通过促进小胶质细胞的抗炎表型的激活从而对CV疾病发挥调节作用，可能是刺五加改善CV的另一个关键机制。

本研究仍存在样本量的限制，因此需要更大的患者样本；此外，需进一步设计实验确定刺五加对DRD2基因表达调节的下游机制及对小胶质细胞M1/M2极化调节的机制。

综上所述，本研究初步证实CV患者经刺五加治疗后DRD2启动子区域呈现低甲基化率，且刺五加可促进小胶质细胞向M2型极化发展，我们的研究为CV疾病的诊断靶点探索及对刺五加治疗CV的机制研究提供实验基础。