香砂六君子汤调控CircRNA-0067835对脾虚高脂血症大鼠胆固醇外排的影响

孟嘉伟,宋囡,王莹,陈丝,王群,赵秋宇,贾连群

(辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室,辽宁 沈阳 110847)

近三十年来,中国人的血脂水平逐步升高,显著增加了以血脂异常为基础的心血管疾病的发病率[1]。采取有效的治疗手段将减轻血脂异常引起的相关疾病负担。血脂异常属于中医学“痰湿”“痰浊”“痰瘀” 等范畴。《医宗必读》云:“脾为生痰之源”[2]。可表明脾与膏脂痰湿的生成之间存在着密切关系。脾为升清降浊的重要枢纽。脾虚,意味着脾的运化功能受损,被视为加重血脂异常的关键病机之一[3]。课题组前期在此病机的基础上,选取健脾降浊法作为治疗的主要方法,选取益气化痰,理气畅中的经典方剂香砂六君子汤治疗脾虚高脂血症大鼠。并对香砂六君子汤治疗剂量进行筛选,发现正常剂量(5.67 g·kg-1·d-1)和高剂量(11.34 g·kg-1·d-1)治疗高脂血症效果明显,香砂六君子汤在调节胆固醇逆向转运及纠正失功能高密度脂蛋白等方面疗效显著[4-5]。目前,非编码RNA的深入研究为传统医学开启了疾病防治的新征程。微小核苷酸(miRNAs)作为非编码RNA中重要的一部分,随着相关研究的不断深入,临床和实验研究揭示了miRNAs在肝脂肪变性发生、发展过程中的关键作用[6-8]。环状RNA(CircRNA)可以通过“海绵化”目标miRNA和调节miRNA靶向转录本的表达,在生物过程中起着重要作用[9]。本实验选用高脂血症大鼠探讨香砂六君子汤是否可以通过调控CircRNA-0067835/miR-155，调节高脂血症大鼠过氧化物酶体增殖体激活受体-γ(PPARγ)所介导的肝脏胆固醇外排,从而改善高脂血症,为中医药在临床中的作用机制研究提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

30只SPF级SD大鼠,8周龄,体质量(190±20) g,由辽宁长生生物科技股份有限公司提供,于辽宁中医药大学实验动物中心单笼饲养,饲养湿度维持40%～70%,温度维持18～22 ℃,采取12 h/12 h模式进行昼夜明暗交替。实验动物许可证号:SCXK(辽)2015-0001。实验动物伦理审查编号:21006092017056。

1.2 药物

1.3 主要试剂及仪器

TC、TG、LDL-C、HDL-C试剂盒(四川迈新生物技术有限公司,批号:CH0103152、CH0105151、CH0105162、CH0105161);苏木素-伊红(HE)染色液(碧云天生物技术有限公司,批号:C0105);反转录试剂盒、qPCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司,批号:CW2582M、CW2601M);动物组织总RNA提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司,批号:RE-03014);PPARγ、肝X受体(LXR)、腺苷三磷酸结合盒转运体G1(ABCG1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(美国Proteintech公司,批号:16643-1-AP、14351-1-AP、13578-1-AP、10494-1-AP);腺苷三磷酸结合盒转运体A1(ABCA1)抗体(美国Immunoway公司,批号:YN2847)。

Dmilled型普通光学显微镜(德国Leica公司);TBA-120FR型全自动生化分析仪(日本Toshiba公司);ST16R型冷冻高速离心机(美国Thermo公司);MultiskanTMFC型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);BioSpec-nano型紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)。

2 方法

2.1 分组与造模

对30只SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、高脂组、脾虚高脂组、香砂六君子汤高剂量组及香砂六君子汤正常剂量组,每组6只。脾虚高脂组、香砂六君子汤高剂量组及正常剂量组大鼠建立脾虚模型,采用不节饮食加游泳至力竭的造模方法:饱食1 d,禁食2 d,不控制饮水；与此同时,每日放置大鼠于35～37 ℃水中游泳,直至力竭,连续15 d。根据文献对大鼠脾虚证进行评估[10],当大鼠出现游泳耐力下降、体质量减轻、食量减少、粪便时软时溏、倦怠懒动、毛色枯槁无光泽等表现时,证明脾虚模型造模成功。

随后建立高脂血症模型,除空白对照组外其余4组饲喂高脂饲料14周,期间自由摄食,不限制饮水。

2.2 给药

从建立高脂血症模型的第10周开始灌胃给药。根据前期研究[4-5]以及香砂六君子汤人体的临床等效剂量换算[11]，香砂六君子汤正常剂量组及香砂六君子汤高剂量组分别给予香砂六君子汤5.67、11.34 g·kg-1·d-1灌胃,其他3组灌胃等体积的生理盐水,给药4周后取材。

2.3 指标检测

2.3.1 血脂水平检测 取材前12 h停止供食,饮水不限,麻醉后取腹主动脉血,检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。

2.3.2 HE染色观察肝脏组织病理形态 采用4%组织细胞固定液浸泡肝脏组织,达24 h以上,梯度脱水,包埋组织、切石蜡成5 μm厚片放置蒸馏水中浸泡2 min,HE染色5 min后,流水冲洗10 min,于95%乙醇中脱水处理2 min,二甲苯5 min,透明,重复洗涤2次,滴加中性树胶封片,晾干,观察。

2.3.3 油红O染色观察肝脏脂质沉积 将肝组织置于4%多聚甲醛中,依次于15%、30%蔗糖中脱水,包埋,制作冰冻切片,油红O染色10 min,75%乙醇分化2 s,1 min水洗后苏木素复染2 min,流水冲洗返蓝,甘油明胶封片后观察。

2.3.4 qPCR检测各组大鼠肝脏CircRNA-0067835、miR-155、PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1基因表达情况 用试剂盒提取各个样品的RNA,将RNA逆转录成cDNA,设定PCR反应条件,用SYBR Green Mater Mix试剂检测各待测基因的mRNA或miRNA水平;PCR扩增反应条件为95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40个循环;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 15 min。用2-ΔΔCt法分析基因相对表达量，ΔCt值为目的基因Ct值与内参基因(GAPDH,U6)Ct值的差值,ΔΔCt为各实验组ΔCt与空白对照组ΔCt的差值。qPCR引物由通用公司设计合成,序列见表1。

1.1 一般资料 选取自2013年2月至2018年2月漳州市第三医院收治的的80例继发性甲状旁腺功能亢进患者为研究对象，按随机数字表法分为手术组与研究组，每组各40例。手术组男性24例，女性16例；年龄51～76岁，平均年龄(64.5±2.3)岁。研究组男性19例，女性21例；年龄55～78岁，平均年龄(63.3±1.9)岁。两组的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

表1 qPCR引物序列Fig.1 The qPCR primer sequence

2.3.5 Western blot法检测PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1蛋白表达情况 称取肝脏组织0.1 g于EP管中,加入1 mL裂解液,在冰上使用研磨机充分研磨组织,静置30 min后,在12 000 r·min-1、4 ℃、10 min的条件下进行离心,取上清。采用BCA试剂盒对蛋白进行定量分析。按比例加入上样缓冲液,100 ℃下将试剂变性5 min,以每组60 μg为标准计算出样本的上样体积,放板,注入电泳液,加入对应体积,开始电泳。电泳结束后,开始转膜,100 V、80 min恒压湿转,5%脱脂奶粉摇床封闭1 h,加入配比稀释的一抗,4 ℃过夜孵育。次日,TBST清洗10 min,重复4次,洗掉一抗。按照1∶8 000比例稀释二抗,孵育1 h,TBST清洗10 min,重复4次,洗掉二抗。曝光。应用Alpha View软件进行分析。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠血脂水平比较

见表2,相较于空白对照组,高脂组和脾虚高脂组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著升高,HDL-C水平显著降低(P<0.01)。相较于脾虚高脂组,香砂六君子汤高剂量组和正常剂量组TC、TG、LDL-C显著降低,HDL-C显著升高(P<0.01)。香砂六君子汤高剂量组和正常剂量组之间部分指标存在显著性差异(P<0.05,P<0.01)。

表2 各组大鼠血脂水平比较Table 2 The comparison of serum lipid levels in each group

3.2 各组大鼠肝脏组织病理形态比较

空白对照组肝细胞明显可见居中且圆的细胞核,肝窦表现正常,存在结构清晰的细胞索;相较于空白对照组,高脂组和脾虚高脂组大鼠肝组织明显空泡化,细胞肿大,形态疏松,一部分细胞核偏向细胞膜；相较于高脂组，脾虚高脂组肝组织空泡密度更大,泡沫化更明显;香砂六君子汤高剂量组与正常剂量组大鼠肝脏组织的空泡显著减少,肿胀的肝细胞得到改善,胞核趋于正常,可见整齐排列的细胞,香砂六君子汤高剂量组病理形态改善情况较正常剂量组明显。见图1。

图1 各组大鼠肝脏组织病理形态比较(HE,×200)Fig.1 Comparison of pathological morphology of liver tissues in each group(HE,×200)

3.3 各组大鼠肝脏组织脂质沉积情况比较

空白对照组大鼠肝脏细胞排列规整,肝细胞内未见橘红色脂滴,细胞核为蓝色,肝窦结构正常;高脂组大鼠肝脏细胞肿胀明显,肝细胞间隙变宽,视野出现弥漫性橘红色脂滴,细胞核大小不等,脂质蓄积程度明显加重;脾虚高脂组大鼠呈现更加肿胀的肝细胞,脂滴密度相较于高脂组更甚,脂质沉积情况更加严重,经香砂六君子汤治疗的2组肝脏细胞内橘红色脂滴显著减少,细胞核明显变小,肝窦结构有所恢复或恢复正常,脂质蓄积程度显著减轻;其中,香砂六君子汤正常剂量组脂质蓄积减轻效果不如香砂六君子汤高剂量组。见图2。

图2 各组大鼠肝脏组织脂质沉积情况比较(油红O,×200)Fig.2 Comparison of lipid deposition of liver tissues in each group (Oil red O, ×200)

3.4 各组大鼠肝脏CircRNA-0067835、miR-155与PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA表达的比较

相较于空白对照组,高脂组与脾虚高脂组大鼠肝脏miR-155表达升高(P<0.01),CircRNA-0067835与PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA表达降低(P<0.01);相较于脾虚高脂组,香砂六君子汤高剂量组与正常剂量组大鼠的miR-155表达降低(P<0.01),CircRNA-0067835与PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA表达升高(P<0.01)。见图3。

注:与空白对照组比较,**P<0.01;与脾虚高脂组比较,▲▲P<0.01;与香砂六君子汤正常剂量组比较,图3 各组大鼠肝脏CircRNA-0067835、miR-155与PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA表达的比较Fig.3 The expressions of CircRNA-0067835, miR-155 and PPARγ, LXR, ABCA1, ABCG1 mRNA in each group

3.5 各组大鼠肝脏PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1蛋白表达的比较

相较于空白对照组,高脂组与脾虚高脂组大鼠肝脏PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01);相较于脾虚高脂组,香砂六君子汤高剂量组与正常剂量组大鼠PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1蛋白表达量显著升高(P<0.01)。见图4。

注:与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01;与脾虚高脂组比较，图4 各组大鼠肝脏PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1蛋白表达的比较Fig.4 The expressions of PPARγ， LXR， ABCA1， ABCG1 in each group

4 讨论

血脂异常疾病通常是由脂质代谢紊乱或转运异常而引起的,又被称为高脂血症。临床多表现为TC、TG、LDL-C高于正常值和(或)HDL-C低于正常值。在现代研究中,血脂的产生以及血清中TC、TG、LDL-C的升高被认为体现了痰证在微观视野的基础和实质[12]。脾为后天之本,可主运化,主气血生化。“膏脂”的运行依赖于气血的推动,从而濡养全身。《医宗必读》云:“脾土虚弱,清者难升,浊者难降,留中滞膈,瘀而成痰”[2]。脾作为升清降浊的重要枢纽,虚时难以化浊,致使代谢紊乱,是最终导致血脂异常的关键病机,是“痰浊”“血瘀”之类的病理产物生成的重要因素。香砂六君子汤一直被视为益气化痰,理气畅中的经典传统方剂。香砂六君子汤在四君子汤基础上将人参换作党参,增加陈皮、半夏、木香、砂仁4味中药,增强了燥湿祛痰、健脾和胃的功效。

胆固醇逆向转运是胆固醇代谢的关键部分,因而作为胆固醇逆向转运的起始步骤,胆固醇外排是抗血脂异常的关键机制之一[13]。研究表明,PPARγ可参与胆固醇代谢和脂肪细胞功能的调控[14],在肝脏和骨骼肌中高度表达,可以通过对参与脂肪酸吸收/氧化和甘油三酯分解代谢的基因的转录调节，调控细胞内的脂质代谢,是治疗血脂异常的关键受体[15]。CircRNAs是一类新的内源性非编码RNA,在真核转录组中有很高的表达[16]。CircRNA“海绵”作用的发挥主要是通过miRNA,二者结合后,miRNA的作用受到抑制,从而影响下游基因表达[17]。相关实验证实,CircRNA参与脂肪生成与脂解,可以调节脂肪组织的分化和转化。除此之外,CircRNA与巨噬细胞的脂质流出和脂肪分解有一定的关系,参与了脂质代谢的调节和脂质紊乱疾病的发展[18]。实验证明,CircRNA-0067835可以抑制miR-155的表达并通过PPARγ参与胆固醇代谢[19]。PPARγ调控下游基因LXR。LXR调节参与维持脂质稳态的多个基因的表达。研究表明,LXR激动剂对血浆高密度脂蛋白、胆固醇吸收和胆固醇逆向转运有益,是改善血脂异常的重要调节因子[20]。PPARγ和LXR是在巨噬细胞胆固醇稳态中起关键作用的2个核受体,它们均与胆固醇排出的参与者ABCA1、ABCG1激活有关[21]。LXR是控制细胞胆固醇运输的主要因子,通过直接增加ABCA1和ABCG1的水平,使得胆固醇可以从巨噬细胞中顺利泵出[22-23]。ABCA1的主要任务是介导胆固醇向无脂的载脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ)的外排,而胆固醇向高密度脂蛋白颗粒的外排是在ABCG1的参与下完成的[24-25]。调控胆固醇外排在防治血脂异常方面具有重要意义。

本实验发现,高脂饲喂的大鼠血脂升高,肝细胞可见显著泡沫化。而脾虚大鼠可见肝细胞更加显著的泡沫化,血脂水平也存在明显的变化,说明高脂血症大鼠在脾虚的病理状态下，脂质代谢紊乱程度将进一步加重。在香砂六君子汤的干预下,大鼠血脂水平得到改善。香砂六君子汤可能通过上调CircRNA-0067835水平,抑制miR-155基因表达,进而增加PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA与蛋白表达水平,促进肝脏胆固醇外排,达到防治高脂血症的重要作用,然具体调控机制有待进一步完善和证实。