康柏西普对DME患者黄斑部微循环的影响

符树宇，黄雄高，胡卫文，唐吉森，陈又珍，刘 亮

0引言

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病性微血管病变中最严重的并发症之一，而DR患者视力障碍最主要的原因则是糖尿病性黄斑水肿(DME)[1]，血管内皮生长因子(VEGF)已被证实在DME的发病过程中起着重要作用，玻璃体腔内注射抗VEGF药物治疗DME已广泛应用于临床。有报道显示玻璃体腔内注射抗VEGF药物会引起视网膜动脉或静脉收缩、黄斑中心凹无血管区扩大等情况[2]，提示抗VEGF药物可能会导致视网膜缺血加重。目前对于抗VEGF药物是否会引起视网膜缺血加重仍未有统一的观点，相关研究发现使用抗VEGF药物后视网膜微循环变化与房水因子的改变相关[3]。血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)作为缺血性视网膜病变的相关生物标记物，可从细胞因子层面来预测抗VEGF药物治疗DME对视网膜微循环的影响[4]。本研究旨在探讨康柏西普治疗DME对视网膜微循环的影响。

1对象和方法

1.1对象前瞻性对照研究。收集2019-12/2020-12就诊于海南医学院第一附属医院眼科并诊断为DME的患者14例15眼，其中符合筛选条件的10例11眼纳入本研究为DME组，其中男2例，女8例，年龄中位数为56(42～73)岁，右眼7眼，左眼4眼，治疗期间所有DME患者糖化血红蛋白均控制在10%以内[治疗前,治疗后3、5mo平均糖化血红蛋白分别为(8.23±0.966)%、(8.04±0.769)%、(7.91±0.511)%]。选取无全身系统疾病和眼底疾病的年龄相关性白内障患者15例15眼作为白内障组，其中男5例，女10例，年龄中位数为56(53～62)岁，右眼5眼，左眼10眼。选取年龄性别相匹配的正常视力健康人20例20眼作为对照组，其中年龄中位数为47(42～49)岁，其中男8例，女12例。DME组与白内障组年龄比较，差异无统计学意义(P=0.667)；DME组与对照组年龄比较，差异具有统计学意义(P=0.004)。糖尿病患者发生DME年龄都偏大，而年龄较大的健康人群，因其伴有年龄相关性白内障或其他眼部疾病以及全身系统疾病，其最佳矫正视力(BCVA)很难达到1.0，因此我们随机选取了年龄相对匹配且视力正常的健康人群作为对照组，本研究主要观测DME患者注射康柏西普后眼部各项指标变化，对照组一般资料的差异并不影响研究结果。DME组纳入标准：(1)18岁以上的2型糖尿病患者；(2)经荧光素眼底血管造影确诊为非增殖性糖尿病视网膜病变(NPDR)；(3)OCT检测黄斑中心凹视网膜厚度(CMT)≥250μm。排除标准：(1)除DME外引起视力下降的其他视网膜疾病；(2)前6mo内的视网膜治疗或内眼外科手术史；(3)眼压≥25mmHg；(4)屈光不正，近视>6.00D或远视>3.00D；(5)严重的屈光介质不清和其他需要住院的系统性疾病；(6)未完成6次注射而中途终止的患者。白内障组患者纳入标准：(1)确诊为年龄相关性白内障患者，且需行手术治疗；(2)无任何其他眼部疾病；(3)无高血压、糖尿病等全身慢性疾病；(4)无手术史。需收集房水的患者均于术前告知患者，并签署相关知情同意书后，再于术中收集房水样本。本研究通过海南医学院第一附属医院伦理委员会审批。

1.2方法

1.2.1一般检测项目对照组、DME组术前和术后随访均由我院同一名具有经验的眼科技师行眼科Snellen表视力、非接触式眼压、综合验光、眼底照相检查。

1.2.2OCT及OCTA检查应用Cirrus HD OCT 5000光学相干断层扫描仪选择520线×128线黄斑扫描模式，对黄斑中心凹进行扫描，选取B扫描成像清晰的图片，由软件自动计算出CMT;选取黄斑区的6mm×6mm毛细血管扫描模式，获取黄斑区6mm×6mm范围的毛细血管图像。选取内界膜至视网膜内丛状层外界作为视网膜浅层进行测量，视网膜浅层毛细血管中心凹无血管灌注区(FAZ)面积由同一名眼科医师应用Cirrus HD 5000 V.10.0 Angio Plex Metrix软件测量，人工描绘出FAZ边界，再由软件自动计算出FAZ面积。视网膜浅层毛细血管长度密度(VSCP)和视网膜浅层毛细血管灌注密度(PSCP)均由同一款软件自动测量，测量范围为以黄斑中心为中点、6mm×6mm的方形区域。VSCP为通过描绘血管的线性长度，计算区域内线性长度与区域面积的比值;PSCP为通过描绘血管直径宽度，计算血管管径在区域内的覆盖面积与区域面积的比值。

1.2.3房水因子检测检测细胞因子的方法：术中房水收集在无菌管后立即存放在-80℃的实验用冰箱中，采用Luminex检测技术进行检测，检测试剂盒为LXSAHM-09,经过样品稀释、混匀、吸附和孵育等步骤，所有步骤均严格按照说明书进行操作，样品与标准品送微球悬浮阵列技术(Luminex200TM)检测仪检测，自动计算获得样品浓度。

1.2.4手术方法DME组均行每月1次玻璃体腔注射康柏西普眼用注射液共计6次，术前使用盐酸左氧氟沙星滴眼液1d，并于当日手术前冲洗结膜囊。手术中用盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉患眼并严格按照内眼手术规范进行消毒铺巾。在注射康柏西普前,使用1mL注射器针头于颞侧角膜缘穿刺入前房,抽取房水约0.1mL,撤针后角膜穿刺口自闭。随后用1mL注射器抽取0.05mL康柏西普于颞上方角膜缘后3.5～4.0mm向玻璃体腔内垂直进针注药，完成注射后迅速拔出针头,用镊子夹闭穿刺点防止返流。术后使用抗生素眼膏涂于结膜囊内，并连续3d使用左氧氟沙星滴眼液点眼，每天4次。治疗后1mo再次注射,共连续注射6次。白内障组患者均于术中行透明角膜切口前使用1mL注射器针头抽取房水约0.1mL。所有操作均由同一位经验丰富的眼科医师完成。

2结果

2.1术前DME组与对照组PSCP、VSCP、FAZ面积的对比DME组术前PSCP、VSCP较对照组小，FAZ面积较对照组大，差异均有统计学意义(P<0.01,表1,图1)。

图1 DME患者注射康柏西普后黄斑区视网膜OCTA、OCT图像 A：术前；B：注射1mo时；C：注射2mo时；D：注射3mo时；E：注射4mo时；F：注射5mo时。

表1 DME组与对照组术前BCVA、CMT、VSCP、PSCP、FAZ面积对比

2.2术前DME组与对照组CMT及BCVA的对比术前DME组CMT、BCVA值均较对照组高，差异均有统计学意义(P<0.001，表1)。

2.3术前DME组与白内障组相关房水因子对比DME组术前房水中IL-6、IL-8、VEGF、ANGPTL4均较白内障组高，差异均有统计学意义(P<0.001，表2)。

表2 术前DME组与白内障组相关房水因子浓度对比 pg/mL

2.4康柏西普治疗后DME患者PSCP和VSCP及FAZ面积的变化DME患者注射康柏西普前后不同时间PSCP比较，差异有统计学意义(F=4.562，P<0.05，表3)，注射康柏西普前后不同时间VSCP、FAZ比较差异均无统计学意义(F=0.376、0.084，均P>0.05)。注射康柏西普2、3、4、5mo时PSCP与基线，注射康柏西普1mo时与注射4、5mo时比较，差异具有统计学意义(P=0.035、0.004、0.001、0.001、0.026、0.013)，其余时间点两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3，图2。DME组患者于注射康柏西普1mo时PSCP改善最明显。与基线相比，注射康柏西普5mo时DME患者黄斑部微循环缺血改善。

图2 DME患者注射康柏西普后PSCP、BCVA、CMT的变化 A：PSCP；B:BCVA；C：CMT。

表3 使用康柏西普后DME患者眼部检查各参数变化

2.5康柏西普治疗后DME患者CMT和BCVA的变化DME患者注射康柏西普前后不同时间CMT、BCVA比较，差异均有统计学意义(F=2.935、4.357，均P<0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo时BCVA与基线比较均有改善(P=0.044、0.004、0.001、0.001、0.001)，其余时间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。注射康柏西普2、3、4、5mo时CMT与基线相比差异具有统计学意义(P=0.015、0.006、0.003、0.002)，其余时间点两两相比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3，图1、2。注射康柏西普1mo时BCVA提升以及CMT下降最明显。与基线相比，注射康柏西普5mo时视力明显提高，CMT显著下降。

2.6康柏西普治疗后DME患者房水因子的变化DME患者使用康柏西普后不同时间房水ANGPTL4、VEGF、IL-6浓度比较，差异有统计学意义(均P<0.05)，不同时间房水中IL-8浓度变化无统计学意义(P>0.05)。注射康柏西普3、4、5mo时房水中ANGPTL4的浓度与基线相比差异具有统计学意义(P=0.015、0.006、0.003)，其余时间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo时房水中VEGF的浓度与基线，注射康柏西普3、4、5mo时与1mo时相比差异均具有统计学意义(P=0.001、0.001、0.001、0.001、0.001、0.047、0.023、0.015)，其余时间点两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo时房水中IL-6浓度与基线相比差异具有统计学意义(P=0.035、0.001、0.001、0.001、0.001)，其余时间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。DME组患者于注射康柏西普1mo时房水中ANGPTL4、VEGF及IL-6浓度下降最明显，见表4。与基线相比，注射康柏西普5mo时 ANGPTL4、VEGF、IL-6下降。

表4 使用康柏西普后DME患者房水因子浓度变化 pg/mL

2.7康柏西普治疗后各参数变化的相关性分析DME患者每月注射康柏西普1次连续6mo后VEGF变化的绝对值与CMT变化的绝对值呈正相关(rs=0.716，P=0.013)，表明房水中VEGF浓度越降低，CMT越降低，与其余各参数的变化绝对值均无相关性(P>0.05)。

3讨论

本研究结果显示，DME组连续每月1次注射康柏西普6mo后浅层毛细血管密度逐渐增加，VSCP略有增加及FAZ面积减小的趋势，与Zhu等[5]的研究结果相似，并且DME组患者在第1次注射康柏西普后PSCP改善最明显，但其改善视网膜缺血的机制尚未明确。既往研究认为持续高血糖状态会产生晚期糖基化终产物(AGEs)，AGEs可引起血管硬化、激活AGEs内皮受体而增加相关细胞因子表达，最终导致毛细血管收缩、视网膜缺血缺氧。视网膜缺血缺氧状态下，机体代偿性产生VEGF以恢复血液供应。但玻璃体腔内高浓度的VEGF会引起内皮细胞、血-视网膜屏障的破坏，并在血管内募集白细胞增加其对视网膜血管内皮细胞的黏附，导致血管堵塞和灌注减少，最终加重视网膜缺血缺氧。有研究显示使用抗VEGF药物可以改善DME患者视网膜血管灌注，其机制可能为抑制VEGF可以减少白细胞堵塞，使封闭血管再灌注[6-7]。此外，在一项关于抗VEGF治疗肿瘤的研究中，发现抑制VEGF可以破坏缺乏外周细胞的血管，将未成熟的血管重塑为更成熟的血管，并且稳定基底膜为新生血管再次生长提供框架，该机制可能同样作用于视网膜内[8-9]。

研究显示ANGPTL4水平与视网膜血流供应相关，其通常表达于缺血性视网膜病中[10]。ANGPTL4与视网膜血流供应相关的原因在于其不仅促进动脉硬化，还促进血管炎症并增加其通透性，加重视网膜缺血[11]。相关研究发现，缺血性视网膜病小鼠模型中，随着缺氧诱导因子-1(HIF-1)在缺氧视网膜Müller神经胶质细胞中的积累，ANGPTL4表达增加，可以作为反映视网膜缺血相关的生物标志物[12]。此外，Kwon等[4]的研究发现使用抗VEGF药物可以减少DME患者视网膜血管的丢失，并恢复无灌注区血供，通过检测房水中ANGPTL4的浓度发现，ANGPTL4的浓度与视网膜无灌注区面积成正相关，并认为ANGPTL4可反映视网膜血液供应情况。结合本研究结果，注射康柏西普后DME患者房水中ANGPTL4浓度下降，并于注射康柏西普1mo时下降最显著，因此本研究结果从细胞因子层面证实注射康柏西普可以改善黄斑部微循环缺血。

本研究结果显示，注射康柏西普后，DME患者BCVA显著提高，CMT显著下降，并均于注射康柏西普1mo时改善最显著，与Zhou等[13]的研究结果一致。既往研究已证实，VEGF是引起DR患者黄斑水肿的重要因子，其作用机制是高浓度的VEGF破坏血管内皮细胞及血-视网膜屏障，引起黄斑水肿[1]。康柏西普是我国自主研发的新型抗VEGF药物，它是一种重组融合蛋白，含有VEGF受体1(VEGFR1)的第二个免疫球蛋白(Ig)结构域和VEGFR2的第三和第四Ig结构域和人IgG的Fc区，它可以与VEGF-A、VEGF-B和胎盘生长因子(PlGF)的所有同工型结合。理论上它对VEGF的亲和力较单抗类药物更强[14]。Liu等[15]关于康柏西普与雷珠单抗治疗DME患者疗效的研究发现，两者对BCVA都有提升作用，但康柏西普减轻黄斑水肿的效果优于雷珠单抗。可能的原因在于：融合蛋白类的康柏西普，其在玻璃体腔内的半衰期为4.2d，较雷珠单抗的2.88d半衰期更长，并且其针对的靶点较单抗类药物更多。

本研究结果显示，随着注射康柏西普时间的延长，DME患者房水中的VEGF、IL-6都显著下降，与Xia等[16]的研究结果一致，他们发现使用康柏西普可以显著减轻DR患者视网膜病变程度，以及显著降低IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子水平，证明康柏西普对这些炎症因子有抑制作用。其原因可能是DME发展过程中VEGF和炎症因子作用途径大量重叠，VEGF可刺激促炎基因的表达，并允许白细胞渗透到视网膜中[17]。值得注意的是注射康柏西普1mo时，DME患者房水中VEGF、IL-6浓度下降十分显著，与Zhang等[18]的研究结果相似，其研究发现注射康柏西普1wk后患者房水中VEGF浓度开始显著下降，反映康柏西普对VEGF有十分强的抑制作用。理论上VEGF作为一种促炎介质，抗VEGF治疗可以抑制眼内炎症因子水平。

此外，分析本研究中VEGF与CMT变化的绝对值发现，VEGF浓度与CMT呈正相关，与Mastropasqua等[6]的研究结果一致。侧面证实了VEGF在DME的发展过程中至关重要的作用。

本研究选择浅层毛细血管的变化反映黄斑区视网膜血液供应的原因：(1)HD-OCT获取的浅层毛细血管密度清晰度最佳；(2)深层毛细血管的末端会被肿胀的视网膜遮挡而影响毛细血管密度的测算[19]。本研究运用PSCP、VSCP进行分析，来反映视网膜毛细血管变化。视网膜的血液供应与毛细血管的管径大小、血液的流动速度以及血液的氧含量有关，而在评价血液供应方面PSCP优于VSCP。

本研究从细胞因子层面证实了使用康柏西普治疗DME可以改善黄斑区缺血。同时本研究没有发现使用康柏西普治疗后加重视网膜缺血等情况,说明使用康柏西普治疗从安全角度考虑是可行的。此外，使用康柏西普治疗DME能有效提升BCVA及减轻黄斑水肿。但本研究也存在随访时间短、样本量小，对远期效果未能观察等不足，在后续研究中还需进行更多关于康柏西普治疗DME相关的细胞因子及其作用途径的研究才能解释其如何改善视网膜缺血。