黄连温胆汤调控PI3K/Akt/mTOR信号通路干预ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的作用机制

杨金果，鞠建庆，汤献文，严权浩

随着社会老龄化加重及居民不健康生活方式，我国心血管疾病发病率、死亡率持续升高，疾病负担日渐加重，防治心血管疾病刻不容缓[1]。动脉粥样硬化是动脉粥样硬化性心血管病的重要病理基础[2]。既往研究表明，抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳动物西罗莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路可诱导巨噬细胞自噬，减轻炎症反应，延缓动脉粥样硬化进展。黄连温胆汤是治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的常用复方，动物实验表明，其具有降低血脂水平，减小主动脉斑块面积和抑制动脉粥样硬化病程进展的作用[3]。黄连温胆肠能否通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥抗动脉粥样硬化作用的研究报道较少。本研究采用黄连温胆汤为干预措施，高脂饲料饲养的载脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠为动脉粥样硬化动物模型，探讨黄连温胆汤对动脉粥样硬化的干预效应及其与PI3K/Akt/mTOR信号通路的关系，以期揭示黄连温胆汤干预动脉粥样硬化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7～8周龄无特定病原体(SPF)级ApoE-/-小鼠30只，相同周龄C57BL/6J小鼠6只，雄性，体质量(25±5)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006，批号：1100111911017204。高脂饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：京饲证(2014)06057，批号：1103221900009954。

1.2 实验药物与试剂 黄连温胆汤组方：黄连10 g，半夏15 g，竹茹10 g，枳实15 g，陈皮15 g，茯苓15 g，生姜5 g，炙甘草5 g，水煎2次合并浓缩为1 g/mL，置于4 ℃保存备用。雷帕霉素(aladdin，批号：CAS53123-8)；氯化钠注射液(石家庄四药有限公司生产，批号：H13023201)；三酰甘油(TG)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司生产，批号20190810)；总胆固醇(TC)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司生产，批号20190810)；低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司生产，批号20190810)；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司生产，批号20190810)；Anti-PI3K抗体(美国Abcam，批号ab182651)，Anti-Akt1/Akt2/Akt3抗体(美国Abcam，批号ab179463)，Anti-mTOR抗体(美国Abcam，批号ab32028)。

1.3 实验仪器 电子天平(Sartorius公司，型号：BSA3202S-CW)，小动物体重天平(上海越平科学仪器有限公司，型号：YP1002)；迈瑞BS-420全自动生化仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；高清成像系统，佳能(Canon)EOS 5D。

1.4 实验方法

1.4.1 实验造模、分组及给药 ApoE-/-小鼠30只，适应性饲养1周，给予高脂饲料饲养4周，建立动脉粥样硬化模型[4-6]，随机分为模型组、雷帕霉素组[4 g/(kg·d)]、黄连温胆汤低剂量组[9 g/(kg·d)]、黄连温胆汤中剂量组[18 g/(kg·d)]、黄连温胆汤高剂量组[36 g/(kg·d)]，每组6只小鼠。同时选取雄性C57BL/6J小鼠6只作为对照组，给予普通饲料饲养。各给药组给予相应药物灌胃，对照组、模型组给予等体积纯净水灌胃。4周后处死小鼠取材。

1.4.2 观察指标

1.4.2.1 血脂 从小鼠眼球静脉丛取血，将离心管静置室温2 h，待血液凝固成血块收缩后，3 000 r/min离心10 min，取上清液于离心管中，采用全自动生化分析仪检测小鼠血脂TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.4.2.2 病理学染色 苏木精-伊红(HE)染色：取小鼠主动脉根部组织，石蜡包埋，切片，脱蜡，覆水，苏木素染液染色5 min，流水冲洗，1%盐酸乙醇分化3～5 s，返蓝，0.5%伊红染液染色1 min，脱水封片。Masson染色：取小鼠主动脉根部组织石蜡包埋，切片，脱蜡，Masson染色试剂盒内Weigert氏铁苏木素染5 min，流水冲洗，1%盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗数分钟返蓝，丽春红酸性品红液染5～10 min，蒸馏水快速漂洗，磷钼酸水溶液处理3～5 min，苯胺蓝液复染5 min，1%冰醋酸分化处理1 min，脱水封片。油红O染色：取小鼠主动脉根部组织取材后使用OCT包埋，进行6～8 μm冰冻切片，之后将组织粘贴于载玻片上，蒸馏水冲洗，油红O工作液10～15 min，75%乙醇分化2 s，水洗，苏木素1～2 min，水洗，盐酸乙醇分化，返蓝，水洗，纸巾擦去周围水，甘油明胶封片。

观察、拍照并采用Image-pro-plus 6.0对图像进行分析。主动脉根部斑块面积即主动脉根部脂质面积与管腔面积百分比，胶原纤维含量即胶原纤维面积与血管总面积(含斑块)百分比。

1.4.2.3 免疫组化法检测PI3K、Akt、mTOR蛋白表达 取小鼠主动脉根部组织并用石蜡常规切片，脱蜡，蒸馏水冲洗3 min，3次，3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，微波加热抗原修复，10%正常羊血清孵育，滴加一抗，4 ℃冰箱中过夜，磷酸缓冲盐溶液(PBS)振荡清洗后分别滴加二抗、三抗，DAB显色，苏木素复染，常规封片，观察后拍照。采用Image-pro-plus 6.0对图像进行分析。

2 结 果

2.1 黄连温胆汤对ApoE-/-小鼠血脂水平的影响 与对照组比较，模型组TC、TG、LDL-C升高，HDL-C降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，黄连温胆汤低剂量组TG降低(P<0.05)，TC、LDL-C有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，黄连温胆汤中剂量组LDL-C、TG降低(P<0.05)，TC有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，黄连温胆汤高剂量组TC、TG、LDL-C均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，黄连温胆汤低剂量组、黄连温胆汤中剂量组、黄连温胆汤高剂量组HDL-C比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图1。

与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，＊P<0.05。

2.2 黄连温胆汤对ApoE-/-小鼠主动脉根部斑块病理形态学的影响 主动脉根部HE染色显示：对照组小鼠主动脉根部血管壁层次清晰，内膜平滑完整，无粥样斑块沉积。模型组与各给药组小鼠主动脉根部均有不同程度的粥样斑块沉积。模型组易损斑块特征明显，管壁弥漫性增厚，斑块体积大，斑块内脂核大、数量多，可见大量泡沫细胞和胆固醇结晶沉积，纤维帽细薄或不连续，中膜变薄；各给药组小鼠主动脉根部斑块面积减小，病变较局限，粥样斑块纤维帽厚，脂核小，泡沫细胞及胆固醇结晶少，斑块趋于稳定。详见图2。

图2 各组小鼠主动脉根部HE染色图(A为对照组；B为模型组；C为雷帕霉素组；D为黄连温胆汤低剂量组；E为黄连温胆汤中剂量组；F为黄连温胆汤高剂量组)

2.3 黄连温胆汤对ApoE-/-小鼠主动脉根部斑块面积的影响 油红O染色显示：对照组小鼠主动脉根部血管内膜光滑完整，未见动脉粥样硬化斑块；与模型组比较，黄连温胆汤低剂量组、黄连温胆汤中剂量组主动脉根部斑块面积有减小趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；雷帕霉素组、黄连温胆汤高剂量组较模型组主动脉根部斑块面积减小(P<0.05)；但雷帕霉素组与黄连温胆汤高剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图3、图4。

图3 各组主动脉根部油红O染色图(A为对照组；B为模型组；C为雷帕霉素组；D为黄连温胆汤低剂量组；E为黄连温胆汤中剂量组；F为黄连温胆汤高剂量组)

与模型组比较，＊P<0.05。

2.4 黄连温胆汤对ApoE-/-小鼠主动脉根部斑块中胶原纤维含量的影响 Masson染色显示，与模型组比较，黄连温胆汤低剂量组、黄连温胆汤中剂量组小鼠主动脉根部胶原纤维含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；但雷帕霉素组、黄连温胆汤高剂量组较模型组胶原纤维含量升高(P<0.05)；雷帕霉素组、黄连温胆汤高剂量组胶原纤维含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图5、图6。

图5 各组主动脉根部Masson染色图(A为对照组；B为模型组；C为雷帕霉素组；D为黄连温胆汤低剂量组；E为黄连温胆汤中剂量组；F为黄连温胆汤高剂量组)

与模型组比较，＊P<0.05。

2.5 黄连温胆汤对ApoE-/-小鼠主动脉PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响 与模型组比较，雷帕霉素组、黄连温胆汤中剂量组和黄连温胆汤高剂量组小鼠主动脉PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，黄连温胆汤低剂量组有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。详见图7～图10。

图7 各组主动脉根部病变区PI3K蛋白免疫组化染色图(A为对照组；B为模型组；C为雷帕霉素组；D为黄连温胆汤低剂量组；E为黄连温胆汤中剂量组；F为黄连温胆汤高剂量组)

图8 各组主动脉根部病变区Akt蛋白免疫组化染色图(A为对照组；B为模型组；C为雷帕霉素组；D为黄连温胆汤低剂量组；E为黄连温胆汤中剂量组；F为黄连温胆汤高剂量组)

图9 各组主动脉根部病变区mTOR蛋白免疫组化染色图(A为对照组；B为模型组；C为雷帕霉素组；D为黄连温胆汤低剂量组；E为黄连温胆汤中剂量组；F为黄连温胆汤高剂量组)

与模型组比较，＊P<0.05。

3 讨 论

动脉粥样硬化是一种好发于大动脉、中动脉的血管壁慢性炎症病变，发病机制复杂。PI3K/Akt/mTOR信号通路是一条经典的促存活和抗凋亡的信号传导通路，在自噬中发挥核心和关键的调节作用[7-8]。其中PI3K是上游关键分子，负调节自噬，可连接到细胞膜上，进而激活Akt；活化的Akt可解除下游结节硬化复合物对mTOR的抑制作用，增加mTOR活性；活化的mTOR是自噬相关信号通路的核心，可抑制由多种诱因导致的细胞自噬。PI3K/Akt/mTOR信号通路通过调控细胞生存、增殖、凋亡等，参与高血压、冠心病、肿瘤等多种疾病的病理损伤过程。相关研究显示，PI3K/Akt/mTOR信号通路是动脉粥样硬化形成的重要信号传导通路，选择性抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，可诱导巨噬细胞自噬，减少斑块巨噬细胞浸润，抑制炎症反应，继而稳定动脉粥样硬化易损斑块[9-11]。目前已知某些中药有效成分通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，调控巨噬细胞发挥自噬抗动脉粥样硬化。满艺璁等[12]研究显示，化瘀祛痰方通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控动脉粥样硬化家兔肝脏自噬稳态，减缓肝脏脂质损伤，从而改善动脉粥样硬化。张志鑫等[13]研究显示，黄芪甲苷通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制炎症反应，发挥抗动脉粥样硬化的作用。

中医学中无“动脉粥样硬化”病名，根据病人临床表现，归属于“眩晕”“头痛”“中风”“胸痹”“脉痹”等病症范畴，病机属本虚标实，本虚包括气虚、阴虚、阳虚，标实包括血瘀、痰浊、寒凝、气滞、热毒，其中痰浊和热毒是防治动脉粥样硬化的重要病理因素，痰热互结是岭南地区常见病机之一[14]。黄连温胆汤出自清代陆廷珍的《六因条辨》，由宋代医学家陈言《三因极一病症方论》中记载的温胆汤基础上去大枣加黄连而成，药物组方为黄连、半夏、竹茹、枳实、陈皮、炙甘草、茯苓、生姜，主要功效为清热、燥湿、化痰，临床广泛用于内科杂病的治疗，亦是治疗动脉粥样硬化痰热互结证的代表复方[15]。朱瑞等[16]研究显示黄连温胆汤治疗冠心病心绞痛疗效显著。燕珊等[3]动物实验表明，黄连温胆汤具有降低血脂水平、减小主动脉斑块面积和抑制动脉粥样硬化病程进展的作用。

本研究以高脂饲料饲养ApoE-/-小鼠构建动脉粥样硬化模型，探讨黄连温胆汤是否通过PI3K/Akt/mTOR途径发挥抗动脉粥样硬化的作用，结果显示，黄连温胆汤干预后小鼠血清TG、TC、LDL-C较模型组降低，表明黄连温胆汤可降低小鼠血清TG、TC、LDL-C水平，调节脂质代谢。HE染色、油红O、Masson染色显示：模型组小鼠主动脉根部斑块面积增大，脂质含量增多，纤维胶原含量减少，泡沫细胞聚集，且脂核大，纤维帽变薄，斑块不稳定。药物干预后，黄连温胆汤高剂量组小鼠主动脉根部斑块面积比例减小，胶原纤维含量增加，斑块趋于稳定，表明黄连温胆汤具有抗动脉粥样硬化、稳定易损斑块的作用。雷帕霉素组、黄连温胆汤中剂量组、黄连温胆汤高剂量组小鼠主动脉根部PI3K、Akt、mTOR蛋白表达较模型组降低，表明黄连温胆汤可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，诱导巨噬细胞自噬而发挥抗动脉粥样硬化，稳定易损斑块的作用。

综上所述，黄连温胆汤对ApoE-/-小鼠具有良好的降脂及抗动脉粥样硬化，稳定易损斑块作用，其机制可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，诱导巨噬细胞自噬，减轻动脉粥样硬化斑块内脂质负荷和炎症反应有关。