鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗油乳佐剂的筛选及免疫效果评价

黄 坚，李成燚，刘 杰，杜德燕，李 妍

(1.西南民族大学畜牧兽医学院,四川 成都 610041； 2.华派生物工程集团有限公司,四川 成都 641423)

鸡传染性鼻炎(Infectious coryza，IC)是由副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum, Apg)引起的一种急性或亚急性上呼吸道传染病，主要导致蛋鸡的产蛋性能下降(10%～40%)以及育成鸡和肉鸡的生长发育停滞[1].该病在世界范围内广泛流行，给养禽业造成较大的经济损失，而疫苗免疫依然是目前最有效的防治措施[2].根据Page分型法可将Apg分为A、B和C三个血清型[3-4]，不同的血清型菌株都有在国内鸡群中出现流行，但优势流行菌株多有变化，其中以B型菌株的流行较为广泛，且免疫保护具有型特异性[5-6].由于三个血清型之间缺少交叉抗体保护，因此制备针对流行菌株的IC三价(A型+B型+C型)灭活疫苗有着重要的临床意义.目前，禽类灭活疫苗制备所用佐剂主要为油乳佐剂或铝胶佐剂，早期研究显示鸡传染性鼻炎灭活疫苗使用油乳佐剂可提供的较长的免疫保护期及较高的免疫保护水平[7-9]，且免疫效果也优于铝胶佐剂疫苗[10-11]，因此在生产上更受青睐.

目前禽类灭活疫苗多使用油乳佐剂，常制备成油包水(W/O)剂型，使得疫苗抗原在注射部位形成有效的抗原库，产生持续的免疫刺激作用.但油乳佐剂可能会引起一定的不良反应如注射部位的炎症、降解吸收问题等，这与佐剂的成分、质量和稳定性有关[12-13].因此，为了保证鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)三价灭活疫苗的安全性和免疫效力，利于临床推广使用，筛选出最适的油乳佐剂尤为重要.本研究将对比三种不同品牌的矿物油佐剂制备的IC三价灭活疫苗的物理性状、安全性及免疫效力差异，确定最佳的油乳佐剂.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

A型副鸡禽杆菌C-Apg-8株和C型副鸡禽杆菌Apg-668株购自中国兽医药品监察所，B型副鸡禽杆菌Apg-BJ05(北京分离株)株购自北京市农林科学院畜牧兽医研究所，均由华派生物工程集团有限公司保存.B型XN株(四川眉山分离株)和HN株(江苏安徽分离株)为2019年分离的国内流行菌株，由华派生物工程集团有限公司分离鉴定和保存.

1.1.2 培养基和佐剂

鸡血清鸡肉汤、鸡血清鸡肉汤琼脂、半合成培养基等按照文献配方进行制备[7,14]，并添加适量的辅酶Ⅰ(NADH).3种矿物油佐剂分别购自法国道达尔公司(Eolane130)、美国埃克森美孚公司(Marcol-52)和法国赛比克公司(ISA 71VG).

1.1.3 实验动物

80只20日龄和220只6周龄SPF鸡购自济南斯派福瑞禽业科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 抗原制备

将上述3种菌株分别接种鸡血清鸡肉汤琼脂平皿，在5% CO2、37 ℃条件下培养16～18h.挑取典型菌落分别接种半合成培养基，于37 ℃再培养16～24 h，完成一级种子培养，纯粹检验合格后保存于-80 ℃备用.将3个血清型的一级种子，按照3%比例分别接种半合成培养基，于37 ℃培养16～24 h，然后进行纯粹检验和活菌计数.将纯检合格的三个血清型菌液，根据活菌计数结果，经中空纤维超滤器浓缩至制备疫苗所需浓度.再按浓缩菌液体积的0.15%终浓度加入甲醛溶液，于2～8 ℃灭活7 d，期间每日搅拌1～2次.灭活完成后进行灭活检验.

1.2.2 疫苗配制

将灭活检验合格的副鸡禽杆菌抗原(含3个血清型)与三种不同矿物油佐剂(命名为佐剂1、佐剂2和佐剂3)按其推荐的乳化方式制备疫苗，分别制备了SY2019001、SY2019002、SY2019003三批鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)三价灭活疫苗.

1.2.3 疫苗的性状检验

1.2.3.1 外观

应为乳白色乳剂.

1.2.3.2 剂型

应为油包水型.取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第一滴外，均应不扩散.

1.2.3.3 稳定性

吸取疫苗10 mL加入离心管中，以3 000 r/min离心15 min，管底析出的水相应不多于0.5 mL.

1.2.3.4 黏度

按现行《中国兽药典》附录进行测定.

1.2.4 无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行测定，应无菌生长.

1.2.5 不同佐剂疫苗的安全性试验

80只20日龄SPF鸡随机分成4组，每组20只，饲养于相同条件的隔离器，1～3组为免疫组，分别胸部肌肉注射两倍剂量的SY2019001、SY2019002、SY2019003试验疫苗(1.0 mL/只)，第4组为对照组，胸部肌肉注射生理盐水(1.0 mL/只)，观察接种鸡的精神、饮水和采食等状态.免疫后第14天，每组解剖10只SPF鸡，观察注射部位的疫苗吸收情况，其余鸡只继续饲养至第28天，剖检并观察注射部位的疫苗吸收情况.

1.2.6 不同佐剂疫苗的免疫效力试验

120只6周龄SPF鸡随机分为4组，每组30只，饲养于相同条件的隔离器，1～3组为免疫组，分别胸部肌肉注射SY2019001、SY2019002、SY2019003试验疫苗(0.5 mL/只)，第4组为非免疫对照组，免疫后第30天，各组随机选取10只SPF鸡分别用A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒，攻毒方式为眶下窦内注射，攻毒剂量分别为A型C-Apg8株 5.0×105CFU/0.2 mL、B型Apg-BJ05株 2.0×105CFU/0.2 mL、C型Apg-668株 5.0×105CFU/0.2 mL.攻毒后连续观察7天，记录发病情况，计算攻毒保护率.

以筛选的最佳佐剂生产制备鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)三价灭活疫苗，将其免疫50只6周龄SPF鸡(0.5 mL/只)，每组10只，饲养于相同条件的隔离器，另设50只SPF鸡为非免疫对照.免疫后第30天，同时以1株A型、3株B型及1株C型副鸡禽杆菌分别攻毒免疫组及对照组.攻毒方式为眶下窦内注射，攻毒剂量分别为A型C-Apg8株 5.0×105CFU/0.2 mL、B型Apg-BJ05株 2.0×105CFU/0.2 mL、XN株2.0×102CFU/0.2 mL、HN株6.0×102CFU/0.2 mL、C型Apg-668株 5.0×105CFU/0.2 mL.攻毒后连续观察7天，记录发病情况，计算攻毒保护率.

2 结果

2.1 不同佐剂制备疫苗的性状检验及无菌检验

佐剂1、佐剂2、佐剂3分别制备的三种疫苗经外观、剂型、稳定性、黏度检验及无菌检验，结果见表1.三种佐剂均能制备成稳定的油包水剂型，黏度均不大于200 Pa.s，但佐剂3制备疫苗的黏度显著低于佐剂1和佐剂2制备的疫苗.

表1 疫苗的性状及无菌检验结果

2.2 不同佐剂疫苗的安全性

结果显示，安全试验期间，3种佐剂制备的疫苗免疫的SPF鸡均健康存活，精神、饮水和采食等良好，无接种疫苗引起的应激反应.但不同佐剂免疫组注射部位的疫苗吸收情况差异显著.其中，佐剂1制备的SY2019001免疫组免疫后第14天及第28天，注射部位的疫苗吸收效果均弱于另外两种佐剂免疫组(见表2及图1)，注射部位有无法吸收的白色液体或黄色颗粒.佐剂2和佐剂3免疫组在免疫后第14天均有大部分剖检的SPF鸡的注射部位存在黄色颗粒，但第28天剖检结果显示注射部位的疫苗均已吸收完全，并且佐剂3制备的SY2019003免疫组注射部位的肌肉色泽更接近于对照组.安全性试验结果显示，虽然3种佐剂制备的疫苗免疫后均无应激反应，但佐剂3在注射部位的吸收效果优于佐剂1和佐剂2，其更适用于鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗.

表2 不同佐剂疫苗的安全性试验结果

图1 不同佐剂疫苗免疫组注射部位的疫苗吸收情况

2.3 不同佐剂疫苗的免疫效力

攻毒后的第2天，A型和C型菌株攻毒的对照组鸡只均90%(9/10)发病，B型菌株攻毒的对照组鸡只100%(10/10)发病，表现为眶下窦肿胀明显，流鼻液等典型的鸡传染性鼻炎临床症状.A型和B型菌株攻毒对照组有部分鸡呈一过性失明.攻毒后7天的保护率结果统计见表3.佐剂1制备的SY2019001免疫组对三个不同血清型菌株的攻毒保护率为70%～80%，低于其它两种佐剂制备的疫苗免疫组(攻毒保护率为90%～100%)，即佐剂2、佐剂3制备的疫苗(SY2019002、SY2019003)能对三个血清型副鸡禽杆菌的攻击提供不低于90%的保护.因此，从免疫效力方面考虑佐剂2和佐剂3均适宜用于制备鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗.

表3 不同佐剂疫苗的攻毒保护试验结果

从以上试验结果可见佐剂3为最适佐剂.使用佐剂3生产制备的鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)三价灭活疫苗(批号2019003批)免疫SPF鸡，对三个不同血清型的五株副鸡禽杆菌的攻毒保护率为90%～100%，既能有效抵抗A型C-Apg8株、B型Apg-BJ05株及C型Apg-668株的攻击，也能对近期国内B型流行菌株(HN株及XN株)提供较好的免疫保护(见表4).

表4 佐剂3制备疫苗的攻毒保护试验结果

综上结果可知，佐剂3制备的疫苗黏度低，安全性良好，吸收效果好，且能为免疫鸡群提供不低于90%的免疫保护力，较其它两个佐剂更合适用于制备鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)三价灭活疫苗.

3 讨论

油乳佐剂通过增强机体的非特异性免疫应答及抗原的免疫原性来提升疫苗的性能，其含有的油剂和乳化剂类型及稳定性影响着油乳佐剂的活性.商品化油乳佐剂的成分差别和亲水亲油的平衡值决定了乳化后疫苗的黏度和稳定性，这也直接影响了疫苗的安全性和有效性[12].乳化后的疫苗黏度过高不利于使用时疫苗的抽吸，并可导致其在注射部位不易被吸收，残留量高，影响其安全性.三种佐剂制备的疫苗均为较稳定的油包水剂型，黏度低于200 Pa.s，其中佐剂3制备的疫苗黏度(29.3 Pa.s)显著低于其它两种佐剂疫苗.此外，佐剂3制备的疫苗注射部位的组织吸收效果优于佐剂1和佐剂2组，因此为更适合的候选佐剂.矿物油佐剂疫苗的安全性及效力高低，与乳化工艺、乳剂成分的内在质量密切相关[12-13]，从而导致注射部位的抗原吸收和体内释放产生差异.佐剂3以特定的浓缩轻质矿物油为油相，包含甘露醇和油酸高度精炼的非离子型表面活性剂，可能比佐剂1和佐剂2(以长链矿物油为油相)的吸收代谢性要好.因此，其副反应更小，安全性也更高.

鉴于副鸡禽杆菌的特性及鸡的个体差异，攻毒保护组并未实现100%保护，这可能与不同疫苗候选株的生物学特性以及所选佐剂的活性有关[15-16].本研究中佐剂2和佐剂3组对三个血清型菌株的攻毒保护率(不低于90%)高于佐剂1组(70%～80%)，这与疫苗在注射部位的吸收情况相关.三个血清型Apg之间无交叉保护，而同一血清型不同菌株间存在部分交叉保护[17].已有研究表明血凝素(HA)与副鸡禽杆菌的致病性及免疫原性密切相关[18].本研究所用的B型北京株(BJ-05)制备的疫苗可以对四川眉山(XN株)和江苏安徽(HN株)B型分离株形成良好的交叉保护，推测可能与菌株间保护性抗原同源性高有关.而根据卢冷轶等人的研究报道，B型天津分离株(TJ-1)制备的油佐剂疫苗对大连DL-1(91.7%)和北京BJ-1(63.6%)株的攻毒保护率存在明显差异[19].Yang Xu等人的实验结果也证实，北京BJ-26株制备的疫苗对湖南(HuN22)和北京(BJ-26)株的攻毒保护率要高于现有商品化疫苗的保护率[15]，表明不同地区分离株制备疫苗的免疫保护仍存在差异.因此在后续研究中我们需要持续验证疫苗对不同地区分离株的攻毒保护效果，以对疫苗未来的临床使用给予数据支持.

4 结论

经试验对比表明，三种不同厂家的佐剂中，佐剂3为制备鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)三价灭活疫苗的最适佐剂，其制备的疫苗具有较好的安全性及免疫效力.