酵母发酵法改善沙丁鱼蛋白酶解液风味与品质的研究

吴 宇 方旭波,2,* 陈小娥,3,* 刘政捷 袁高峰 余 辉 杨会成

(1 浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022；2 浙江国际海运职业技术学院，浙江 舟山 316021； 3舟山市海大科学技术研究院，浙江 舟山 316000；4浙江省海洋开发研究院，浙江 舟山 316021)

远东拟沙丁鱼(Sardinopssagax)是一种分布广、资源量大的中上层远洋鱼类，富含ω-3多不饱和脂肪酸及蛋白质。由于其个体小、含脂量高，且鱼腥味较重、刺较多，70%的沙丁鱼被加工为鱼粉饲料[1]。酶法水解是一种有效利用鱼类蛋白资源的途径，然而水解物通常鱼腥味重，某种程度上限制了其在食品工业领域的应用[2]。目前采用微生物发酵是改善鱼蛋白酶解液风味品质的有效途径之一。朱文慧等[3]采用耐盐酵母对鳕鱼骨酶解液进行发酵，发现发酵后酶解液中香气活性化合物和鲜味氨基酸的含量明显增加，风味品质得到显著改善。段旭昌等[4]发现乳酸菌发酵可赋予甲鱼酶解液特殊的发酵香味，改善其整体风味品质。因此，通过微生物发酵不仅可以赋予产物独特的风味，消除鱼蛋白酶解液的鱼腥味，还能够改善产物的品质，为后续开发新型海鲜调味料提供研究基础。

电子鼻技术具有快速便捷、结果客观、不损坏样品等特点，近年来在水产品风味和品质鉴定中应用广泛[5]。电子鼻内置软件可对样本进行主成分分析(principal component analysis, PCA)，通过主成分空间上样本点的距离来分辨风味的差异[6]。康翠翠等[7]研究发现，使用电子鼻PCA分析可以有效区分不同温度条件下花鲈鱼肉风味的差异。与其他风味鉴定和表征技术相比，气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)是一种检测挥发性化合物的新型联用技术，其分离能力更强，也避免了复杂耗时、碎片离子解谱困难等问题，目前被广泛应用于食品风味分析[8]。庞一扬等[9]利用GC-IMS对腌鱼腌制过程中挥发性成分的变化进行分析后发现，腌制后鱼肉中氮氧类、醛酮类、酯类和甲基类化合物种类和含量均增加。

本研究以远东拟沙丁鱼蛋白酶解液为原料，以浙江海洋大学水产食品化学实验室分离筛选的长孢洛德酵母(Lodderomyceselongisporus)[10]进行发酵，通过电子鼻PCA技术判别不同发酵时间、发酵温度以及pH值等条件下发酵产物风味的差异，并以氨基酸态氮含量结合感官评价优化该发酵条件，获得发酵产物后进行游离氨基酸组成分析和必需氨基酸营养评价；采用GC-IMS技术分析酶解液发酵过程中香气物质的动态变化规律，以期为沙丁鱼酶解液的后续加工利用提供工艺参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

远东拟沙丁鱼，舟山市海利远洋渔业有限公司，平均体长15～18 cm，-20℃冰箱冷冻保存；动物蛋白水解酶(1×105U·g-1)，南宁庞博生物工程有限公司；长孢洛德酵母，由浙江海洋大学水产食品化学实验室使用超低温冰箱于-80℃保存；盐酸、甲醛等其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ-2组织捣碎机，常州市金坛友联仪器研究所；SHA-C往复式水浴恒温震荡器、HH-6电热恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；BXH-65电热鼓风干燥箱、SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TGL-16C低速大容量离心机，军事医学科学院实验仪器厂；YXQ-LS-50G压力蒸汽灭菌器，上海科晓科学仪器有限公司；PEN 3电子鼻便携式系统，德国 Airsense公司；L-8900全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；Flavour Spec©风味分析仪，德国GAS公司。

1.3 蛋白酶解液的制备

参照马小燕等[11]的方法并略作修改。使用流水解冻的方式解冻远东拟沙丁鱼，切碎后均质。按照料液比1∶4(w/v)、动物蛋白水解酶添加量4 000 U·g-1、自然pH将样品置于50℃水浴恒温振荡器中酶解6.5 h。反应结束后置于沸水浴中20 min，冷却至室温，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液，置于4℃冰箱冷藏备用。

1.4 长孢洛德酵母发酵工艺优化

1.4.1 单因素试验 量取200 mL远东拟沙丁鱼蛋白酶解液，按酶解液体积分数的0.1%向其中接种长孢洛德酵母菌液，以氨基酸态氮含量和感官评分值为指标，以电子鼻检测结果辅助分析，研究发酵时间(0、6、12、18、24 d)、发酵温度(20、25、30、35、40℃)、酶解液pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)3个单因素对发酵产物风味品质的影响，固定条件设定发酵温度为30℃、发酵时间为12 d、酶解液pH值为5.0，每组各做3次平行试验，并对发酵产物风味进行电子鼻分析。

1.4.2 正交试验 在单因素试验的基础上，以氨基酸态氮含量和感官评分为指标，进行正交优化试验，如表1所示。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Variables and levels used for orthogonal text

1.5 氨基酸态氮含量的测定

氨基酸态氮含量的测定参照王琳等[12]方法，采用甲醛滴定法测定。

1.6 电子鼻分析

电子鼻参数设置参考邝格灵等[13]的方法，将15 mL发酵液置于50 mL烧杯中，用保鲜膜封闭15 min后进行电子鼻检测。测定时间为98 s，载气流速和进样流量均设置为200 mL·min-1。以未经发酵的酶解液为对照组，通过PEN3电子鼻的WinMuster软件对采集到的样品气味信息进行主成分分析。

1.7 感官评价

发酵产物的感官评价参照陈晓婷等[14]的方法并略作修改，采用描述性定量分析法(quantitative descriptive analysis test)进行评价。根据《GB/T 16291.1-2012感官分析选拔与培训感官分析优选评价员导则》[15]中所述的感官分析优选评价员的选拔与培训方法，筛选由10名经过培训的食品专业研究生组成感官评价小组。每组发酵液分别量取50 mL置于3个250 mL锥形瓶中并随机编号，用保鲜膜密封后置于60℃恒温水浴10 min。采用先闻后尝的方式，测试过程中不允许交流讨论。根据表2评分标准[16-17]对发酵产物的风味特性进行独立评价打分，每项满分10分，总分40分，分值越大，说明发酵产物的风味越好，剔除异常数再取平均值为最终结果。

表2 发酵产物风味感官标准Table 2 Sensory evaluation criteria of flavour of fermentation product

1.8 游离氨基酸的测定及营养评价

游离氨基酸的测定参照Yang等[18]的方法并略作修改，将采用优化后工艺制得的发酵液与未经发酵的酶解液的样品于5 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清，分别用一次性注射器吸取3 mL样液于20 mL水解管中，加入10 mL浓度为6 mol·L-1的盐酸溶液，密封，在110℃恒温干燥箱中保温水解24 h，水解完成后于8 000 r·min-1离心10 min，上清液经0.45 μm水性膜过滤后，放入氨基酸自动分析仪样品盒中，上机测定。并参照周仁客等[19]的方法计算发酵产物的氨基酸评分(amino acids score，AAS)、化学评分(chemical score，CS)及必需氨基酸指数(essential amino acids index，EAAI)。

1.9 GC-IMS分析酶解液发酵过程中的风味动态变化

采用优化后的发酵工艺，在发酵过程中每隔6 d取样(0、6、12和18 d)，将同样放置18 d的酶解液作为对照组，使用FlavourSpec©风味分析仪对这5组样品的挥发性风味物质进行检测。参照Li等[20]的方法并略作修改。分别量取1 mL发酵液于20 mL的顶空瓶中密封。随后，将样品在40℃下孵育20 min，孵化转速为500 r·min-1。采用顶空自动进样的方式使用85℃的进样针将500 μL样品注入进样器。

1.9.1 GC条件 色谱柱类型：FS-SE-54-CB-1型(15 m ID:0.53 mm)；载气：高纯N2(纯度 ≥ 99.999%)；柱温：60℃；分析时间：30 min；载气起始流度为2 mL·min-1，保持2 min，在2～10 min内上升至10 mL·min-1，10～20 min内线性上升至100 mL·min-1，20～30 min内上升至150 mL·min-1。

1.9.2 IMS条件 电离源：β 射线(氚3H)，漂移气为高纯N2(纯度 ≥ 99.999%)，温度45℃，流速150 mL·min-1，正离子模式。

1.10 数据分析

应用Origin Pro 8.5软件绘图，使用SPSS 18.0软件Duncan氏法对试验数据进行显著性分析(P<0.05)，电子鼻及GC-IMS数据采用软件自带程序进行分析。

2 结果与分析

2.1 远东拟沙丁鱼蛋白酶解液发酵条件优化结果分析

2.1.1 发酵时间对发酵产物风味与品质的影响 由图1可知，随着发酵的持续，沙丁鱼蛋白酶发酵产物中氨基酸态氮含量不断增加，从12 d开始增速减小，18 d后趋于平缓。此外，当发酵时间为12 d时，发酵液的感官评分最高，风味最好。由图2可知，不同发酵时间下主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的贡献率分别为95.21%和3.93%，总贡献率为99.14%。各处理组间无重叠，说明电子鼻PCA可以获得较好的区分效果，这与朱丹实等[21]的研究结果类似。发酵12、18和24 d的发酵产物在主成分空间上呈线性排列，18 d的发酵产物在PC1上与0 d距离最近，24 d时在PC2上最低。综上，长孢洛德酵母发酵酶解液的适宜发酵时间为12 d。

注：不同大写字母表示氨基酸态氮含量差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示感官评分值差异显著(P<0.05)。下同。Note: DifferenTCapital letters mean significant difference in content of amino acid nitrogen at 0. 05 level, different lowercase letters mean significant difference in score of sensory evaluation at 0. 05 level. The same as following.图1 发酵时间对发酵产物中氨基酸态氮含量及感官评分的影响Fig.1 Effect of fermentation time on the content of amino acid nitrogen and score of sensory evaluation in fermentation product

图2 不同发酵时间发酵产物的PCA图Fig.2 PCA diagram of fermentation product at different fermentation time

2.1.2 发酵温度对发酵产物风味与品质的影响 由图3可知，随着发酵温度的升高，发酵产物中氨基酸态氮的含量呈先上升后略微下降的趋势，在35℃时氨基酸态氮含量最高。此时发酵产物的感官评分也最高，风味更易被接受。由图4可知，不同发酵温度下PC1和PC2的贡献率分别为89.37%和10.16%，总贡献率为99.53%。各样品之间无重叠，说明电子鼻PCA可以很好地将其区分开，这与郑平安等[22]的研究结果类似。与未经发酵的酶解液相比，各处理组在PC1上与其相差较大，说明温度对发酵产物的风味有重要影响。而处理组间在PC1上相差较小，在PC2上相差较大。30、35 和40℃下的发酵产物在主成分空间中相对较集中，在PC2上的差距较小且高于其他两组，35℃下的发酵产物在PC1上与对照组的差异高于30、40℃。综上，长孢洛德酵母发酵酶解液的适宜温度为35℃。

图3 发酵温度对发酵产物中氨基酸态氮含量 及感官评分的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on the content of amino acid nitrogen and score of sensory evaluation in fermentation product

图4 不同发酵温度发酵产物的PCA图Fig.4 PCA diagram of fermentation product at different fermentation temperature

2.1.3 发酵环境pH值对发酵产物风味品质的影响 由图5可知，随着发酵液pH值的升高，发酵产物中氨基酸态氮含量呈先上升后下降的趋势，在pH值为5.0时其含量达到最高。且此pH值条件下，发酵产物的感官评分最高，风味相对较好。由图6可知，不同pH值条件下发酵产物PC1和PC2的贡献率分别为92.18%和7.37%，总贡献率为99.55%，说明样品所受干扰较小，PCA能够较好地反映样品信息，这与朱文慧等[23]的研究结果相似。与未经发酵的酶解液相比，各试验组在PC2上与其相差较大，在PC1上差异较小，说明pH对酶解液发酵有重要影响。pH值 4.5和 6.0在PC2上差异不明显，与其他组差异较明显，而pH值5.0组在PC2上最高。综上，远东拟沙丁鱼酶解液发酵的适宜pH值为5.0。

2.1.4 产香酵母发酵条件优化的正交试验结果 由表3可知，就氨基酸态氮含量而言，各因素影响的顺序为A>C>B，即发酵时间>pH值>发酵温度，对于感官评分值的影响也是如此。综合以上3个因素对发酵产物的影响，得出长孢洛德酵母发酵远东拟沙丁鱼酶解液的最佳条件为A2B3C2，即发酵时间12 d、发酵温度40℃、pH值5.0。量取200 mL的酶解液，按其体积分数的0.1%接种长孢洛德酵母菌液，调节pH值至5.0，于40℃下培养12 d，平行3次。结果表明，氨基酸态氮含量为8.417 mg·mL-1；发酵产物鲜香味浓郁，无腥异味和苦涩味，感官评分为36.749。其中感官评分值高于表3中的数据，说明正交结果具有适用性和可靠性。

图5 pH值对发酵产物中氨基酸态氮含量及感官 评分值的影响Fig.5 Effect of pH value on the content of amino acid nitrogen and score of sensory evaluation in fermentation product

图6 不同pH值下发酵液的PCA图Fig.6 PCA diagram of fermentation product at different pH value

表3 正交试验设计及结果Table 3 Orthogonal experimental design and results

2.2 游离氨基酸组成分析及相关营养评价

由表4可知，酶解液发酵前后游离氨基酸组成相同，共检出16种游离氨基酸，但是其含量存在明显差异。发酵前，酶解液中游离氨基酸的含量为3.886 g·100g-1， 而发酵后的产物中游离氨基酸总量为7.872 g·100g-1，增加了102.57%。各种氨基酸含量的增量均大于50%，其中增量最大的为Tyr(250.93%)，增量最小的为Ala(56.54%)。产物中必需氨基酸含量为3.082 g·100g-1， 鲜味氨基酸含量为3.727 g·100g-1。在游离氨基酸中，Glu含量最多，His含量最少。

表4 游离氨基酸组成分析Table 4 Analysis of free amino acid composition

由表5可知，当远东拟沙丁鱼发酵产物以AAS为评分标准时，Met评分最高，Lys评分最低。以CS为评分标准时，评分最高和最低的同样是Met、Lys，因此Lys为第一限制性氨基酸。EAAI常用来评价蛋白质营养价值[24]，远东拟沙丁鱼发酵产物EAAI为65.76，表明其营养价值较高，可作为潜在的海鲜调味基料。

2.3 酶解液发酵过程中挥发性香味物质动态变化分析

不同发酵阶段发酵液中挥发性化合物的GC-IMS图谱如图7所示，横坐标1.0处红色竖线为反应离子峰(reaction ion peak， RIP，经归一化处理)，RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物，颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深表示浓度越大[25]。可以看出，GC-IMS技术可以很好地分离不同样本的特征挥发性组分，且不同发酵阶段的挥发性风味物质在组成成分及含量上存在明显差异，即使同种物质在不同阶段浓度也有较大差异，如圆圈中的标注的物质。

通过GC-IMS自带软件Library Search中现有的NIST 2014气相保留指数数据库和G.A.S. 的IMS迁移时间数据库，根据保留时间和迁移时间对挥发性化合物进行检索，比对出31种挥发性化合物，主要包括11种醛类、7种醇类、8种酮类、1种酯类、1种烃类及3种呋喃类化合物，结果见表6。

为了进一步研究不同发酵阶段挥发性化合物的变化情况，图8显示发酵0、6、12和18 d的发酵液及对照组中已经比对出的挥发性风味物质GGC-IMS部分指纹图谱，图中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰，每一列代表同一种挥发性有机物在不同样品中的信号峰，亮点的深浅表示化合物含量的高低。A区的物质是对照组中未发酵酶解液的特征风味物质，包括1-辛烯-3-酮、(E,E)-2,4-庚二烯醛和2-乙酰基呋喃等；而B区的物质是发酵初期(0 d)的特征风味化合物，包括苯甲醛、壬醛和2-正戊基呋喃等；C区的物质在对照组和发酵初期大量存在，包括辛醛、2-己烯-1-醇、庚醛、己醛、2-乙基呋喃、乙酸乙酯、丁醛和3-甲硫基丙醛等；D区的少量物质随发酵时间延长含量逐渐升高，如E-3-己烯-1-醇等，可能是由于这个阶段又有酵母参与发酵或者某些化合物发生反应以及随着发酵的进行逐渐积累，为发酵终止时(18 d)的特征峰区域；E区的物质在发酵6 d时含量最高，随着发酵的继续进行，2-己酮、2-戊酮、1-辛烯-3-醇等部分风味物质含量降低；而F区的物质在发酵过程中逐渐积累，并在发酵12 d时含量最高，继续发酵时含量随之减少，包括2-丁酮、3-戊酮、3-辛酮、2-甲基-1-丙醇和糠醛等风味物质；G区中的物质随着发酵时间的延长而降低，部分物质含量增加，如3-辛酮。以上结果可知，未发酵及发酵初期酶解液的主要挥发性物质为A、B、C区的饱和直链醛类、呋喃类等，随着发酵的进行，被逐渐代谢为D、E、F、G区的酮类及不饱和醇类等香气活性物质，并且这些挥发性香味物质的种类和含量在发酵12 d时达到最高，此时发酵产物风味最佳。综上，发酵后远东拟沙丁鱼酶解液的风味品质得到明显改善，可作为营养价值丰富的海鲜调味基料，值得进一步开发利用。

表5 必需氨基酸营养评价Table 5 Nutritional evaluation of essential amino acids

图7 不同发酵阶段挥发性化合物的GC-IMS图谱Fig.7 GC-IMS plot of volatile compounds in different fermentation stages

表6 酶解液 GC-IMS 测定结果Table 6 The results of GC-IMS determination of enzymatic hydrolysate

图8 不同发酵阶段酶解液GC-IMS指纹图谱Fig.8 GC-IMS fingerprint of different fermentation stages

3 讨论

风味菌是一类在代谢过程中将原料中的有机质分解为挥发性风味物质的微生物，对食物风味品质的形成有着重要影响。杨海宁等[17]采用贝莱斯芽孢杆菌SW5菌株对鳀鱼进行发酵，结果显示接种该风味菌后，发酵醪液比未接种发酵和自然发酵具有更多种类的挥发性风味物质。陈超奇[35]在刺葡萄酒发酵过程中提前接种长孢洛德酵母，酒样中的花香、小浆果及真菌的香味特征比较显著。本研究利用长孢洛德酵母对远东拟沙丁鱼酶解液进行发酵，改善了酶解液的风味品质，为其在调味基料中的进一步应用提供了理论基础。

风味是在发酵过程中由不同物质积累逐渐形成，且不同发酵阶段其组成差别较大[36]。在未发酵时及发酵初期，醛类和呋喃类化合物对其风味有着重要的影响。醛类物质阈值较低，是发酵过程中由脂质氧化形成的[37]。饱和直链醛具有令人不适的气味[38]，给对照组及发酵0 d的发酵液风味造成了负面影响。发酵一段时间后，发酵产物中醇类物质的种类明显增多，可能是来源于脂肪酸的二级氢过氧化物分解或羰基化合物还原[39]，也可能是来源于酵母在发酵过程中的代谢产物，可作为风味形成的基础物质。而一些不饱和醇阈值较低，可能会对发酵液风味有较大贡献，如在发酵6 d时明显增多的1-辛烯-3-醇具有类似蘑菇的风味[26]，此类成分使得发酵产物整体品质更佳。随着发酵的进行，发酵产物中酮类物质的种类和含量逐渐增多，并在12 d时达到峰值，是发酵中后期的主体风味物质。酮类物质是由多不饱和脂肪酸或氨基酸降解以及微生物氧化产生，通常具有独特的清香或者果香风味[40]，对发酵产物风味的改良起着重要作用。由此可见，不同发酵阶段产物中的挥发性风味物质存在差异。

游离氨基酸既是发酵产物鲜味的重要成分，也可以与其他组分相互作用，改善产物的风味，同时也是评价发酵产物的重要营养指标[41]。本研究发现，经长孢洛德酵母发酵12 d后，发酵产物中Ile等7种必需氨基酸和Glu等鲜味氨基酸的总量比发酵前明显增多。此外Ala、Gly等含量较高，使得发酵产物的鲜味更加醇厚，品质较发酵前有显著提升。

综上，为改善远东拟沙丁鱼酶解液的风味品质，采用长孢洛德酵母发酵12 d后，产物的香味浓郁，品质较高。

4 结论

本试验考察了发酵时间、发酵温度和pH值对发酵产物风味品质的影响，采用电子鼻PCA分析，并通过正交试验对远东拟沙丁鱼酶解液发酵条件进行了优化。结果显示，在发酵时间为12 d、发酵温度为40℃，pH值为5.0时，发酶产物风味品质最佳，氨基酸态氮含量和感官评分值较高。发酵产物的EAAI为65.76，营养品质较好。GC-IMS分析结果表明，随着发酵的进行，发酵产物中不饱和醇类、酮类等香气活性物质明显增多，并在12 d时达到最高，而饱和直链醛等具有不良风味的物质随着发酵的进行逐渐消失或减少。