基于网络药理学和分子对接技术探讨活血化瘀方治疗糖尿病足的作用机制

贺伟平，黄春

萍乡市人民医院，江西 萍乡 337055

糖尿病是世界上最普遍的疾病之一，并且与高死亡率指数相关，其主要并发症之一是糖尿病足［1］。糖尿病足临床表现为糖尿病患者下肢缺血或下肢神经病变，产生足部溃疡或组织病变，感染或不感染，严重者需要截肢或者导致死亡［2］。古籍最早记载糖尿病足为“脱痈”，后更名为“脱疽”［3］。发病通常在足趾，呈赤黑色。在中国，50 岁以上的糖尿病人中有8.1%患有糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer,DFU），截肢率和死亡率据估计为22%和11%［4］。针对此病，西医采用手术或非手术的方式治疗，比如：控制血糖、调节代谢、增加足部血液微循环，减少感染等等［5］，但效果不佳，且治疗费用高昂，对患者家庭的经济造成一定的困难。随着中医药的发展，关于DFU 的研究和中医诊疗取得了很大的进展。中医治疗DFU 主要从以下几个方面入手：中药外治、针灸推拿和按摩、中药内服等［5］。中药外治包括外洗、膏药贴敷、药粉箍围、中药湿敷等。有学者通过数据挖掘发现对于糖尿病足的外治方法多为活血祛瘀类、祛风除湿类以及清热消肿等药物［4,6］。

本研究采用的活血化瘀方是综合历代中医多年临床经验，在黄芪桂枝五物汤基础上加减而成，含黄芪30 g、桂枝10 g、三七30 g、丹参20 g、鸡血藤20 g、牛膝15 g、桑枝10 g 和甘草10 g 八味药。黄芪是补益类中药，可利水消肿，托毒生肌。桂枝温通经脉，助阳化气。有研究证明黄芪和桂枝配伍可以降低糖尿病足患者的血糖，降低机体炎症［7］。三七化瘀止血，活血定痛，常治疗跌打损伤，瘀血肿痛。研究表明三七总甙对糖尿病足患者具有很好的改善作用，可改善缺血病况，提高患者的康复速度［8］。丹参活血祛瘀，凉血消痈，临床研究表明丹参注射液对糖尿病足的治疗具有较好的疗效［9］。鸡血藤具有活血补血，舒筋活络之功效，有研究表明，鸡血藤水提物能改善糖尿病足大鼠模型的溃疡，降低炎症因子水平［10］。药典记载牛膝可以逐瘀通经，补肝肾，强筋骨；桑枝可以祛风湿，利关节；甘草可调和诸药，并能预防糖尿病并发症。

虽然目前尚无其他已发表的研究关注本活血化瘀方对糖尿病足的治疗效果，但是该方是经萍乡市人民医院（以下简称我院）专家协定而成，又经我院小样本临床实践证明其对DFU 的作用效果良好，所以该方具有很好的研究价值。本研究采用网络药理学和分子对接技术，探讨本组方对糖尿病足的药理机制。基于“成分-靶点-疾病”的互作网络揭示药物和疾病之间的联系，活性成分和疾病之间的联系，通过分子对接技术验证成分靶点之间的作用力，为后续复方制剂的进一步开发和临床应用提供参考。

1 方法

1.1 活性成分收集和靶点筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）分别检索黄芪、桂枝、三七、丹参、鸡血藤、牛膝、桑枝和甘草的化学成分。根据一定条件进行筛选，即口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18，得到该组方的有效成分，然后在数据库里得到有效成分相对应的靶点，在Uniprot 数据库将靶点转换成对应的基因靶点。

1.2 化合物-靶点网络的构建

将“1.1”方法中收集到的成分和靶点构建相互作用网络以了解活血化瘀汤活性成分和对应靶点之间的关系。利用Cytoscape 3.9.0 软件制作网络图。

1.3 疾病靶点收集

以“diabetic foot ulcer”或“diabetic foot”为关键词，在GeneCards 数据库、OMIM 数据库、TTD数据库中搜索糖尿病足的相关靶点。删除重复的靶点，在Uniprot数据库将靶点转换成对应的基因靶点。

1.4 共同靶点的筛选

利用Venny 2.1.0 在线平台分析“1.1”方法中收集到的成分靶点和“1.3”方法中收集到的疾病靶点，取交集，即为活血化瘀方作用于疾病的共同靶点。

1.5 蛋白相互作用（PPI）网络的构建及核心作用蛋白的筛选

将交集靶点导入STRING 数据库绘制PPI 网络图。将网络图导入Cystoscope 软件进行结果分析，根据度值排名统计，得到药物与疾病交互靶点中的核心关键靶点。

1.6 关键靶点GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

为了研究活血化瘀方治疗DFU 的潜在分子机制，运用Metascape 数据库，对上述获得的关键靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析。GO功能富集分析主要包括生物过程、细胞组成和分子功能三个方面。

1.7 “药物-有效成分-靶点-通路”网络的构建

利用Cytoscape 软件，对活性成分、靶点与通路的结果进行综合性分析，构建“药物-成分-靶点-通路”网络图。

1.8 分子对接

根据“1.5”方法中得到的度值排名前3 的核心靶点蛋白及度值排名前3 的成分运用AutoDock软件对两者进行分子对接验证。首先在PDB 数据库中下载核心靶点蛋白的pdb 格式结构文件。在AutoDock 软件中进行一定的操作，如加氢、去水等修饰该蛋白。然后在TCMSP 数据库中下载化学成分的mol2 文件，利用AutoDock 软件对其进行结构修饰。然后在AutoDock 软件中进行分子对接。

2 结果

2.1 活血化瘀方活性成分及靶点的获取

在TCMSP 数据库中检索黄芪、桂枝、三七、丹参、鸡血藤、牛膝、桑枝和甘草的化合物，并按照“1.1”方法中的筛选条件收集化合物，共收集到212 个化合物，其中黄芪20 个，桂枝7 个，三七8个，丹参65 个，牛膝20 个，鸡血藤24 个，桑枝3个，甘草92 个。剔除重复成分后共计212 个，重复成分如下表1。然后依次收集212 个成分对应的靶点，再合并去除重复的靶点，获得290 个靶点，运用Uniprot 数据库将相关靶点转换成对应的基因信息。

表1 活血化瘀汤共同有效成分及对应靶点数目

2.2 成分-靶点相互作用

利用Cystoscope 软件构建活血化瘀汤活性成分和靶点网络，一共得到483 个节点，3 246 条边。通过软件计算所有节点度值，我们发现排名前三的成分为槲皮素，山柰酚和木犀草素。

2.3 糖尿病足的疾病相关靶点获取

用“diabetic foot ulcer”或“diabetic foot”分别检索Genecards、OMIM、TDD 数据库获得疾病靶点，在OMIM 数据库以“diabetic foot ulcer”为检索词获得595 个靶点，以“diabetic foot”为检索词获得601 个靶点，合并剔除重复靶点后共624 个。在TDD 数据库分别用两个检索词检索到靶点20 个。在Genecard 数据库以“diabetic foot ulcer”为检索词获得2 550 个靶点，以“diabetic foot”为检索词获得4 839 个靶点。合并3 个数据库的疾病靶点并剔除重复靶点后获得5 349 个靶点。

2.4 交集靶点收集和PPI 蛋白网络互作关系

利用Venny 2.1.0 在线平台分析对复方靶点和疾病靶点取交集，如图1 所示。205 个共有靶点或为活血化瘀汤治疗DFU 疾病的靶点。将205 个交集靶点导入STRING 数据库绘制PPI 网络图（图2）。将205 个交集靶点和“2.1”收集到的活性成分相互关联，剔除没有交集靶点的成分，得到179个有效成分。将179 个成分和205 个交集靶点用Cystoscope 软件进行分析，得出“成分-疾病靶点”网络互作图（图3），根据度值排名，统计前10 的共表达基因靶点（表2）。

表2 度值排名前10的活性成分和交集靶点列表

图1 活血化瘀汤活性成分靶点与DFU疾病靶点的共同靶点韦恩图

图2 活血化瘀方治疗糖尿病足的靶蛋白PPI网络图

图3 活血化瘀方活性成分与糖尿病足的交集靶点网络图

2.5 活血化瘀方治疗DFU 的分子机制

利用Metascape 数据库将“2.1”获得的205 个共有基因靶点进行GO 和KEGG 通路富集分析。GO功能富集分析依照P 值大小排名绘制条形图（图4）。这些结果表明活血化瘀汤治疗DFU 与细胞对氮化合物的反应、对无机物的反应和对异种生物刺激的反应活性等相关。KEGG 通路富集分析依照P 值大小排名绘制气泡图（图5）。结果表明活血化瘀汤治疗DFU 与调控脂质和动脉粥样硬化，P13K-Akt信号等通路有关。

图4 GO功能富集分析

图5 KEGG信号通路富集分析结果

2.6 “药物-有效成分-靶点-通路”网络的构建

将含有活性成分、交集靶点、富集通路的excel数据表导入Cytoscape 软件，构建“药物-有效成分-靶点-通路”网络图。见图6。

图6 “药物-成分-靶点-通路”网络图

2.7 分子对接验证

将“2.4”结果中表2 里面度值居前3 位的活性成分槲皮素，山柰酚，木犀草素与关键靶点PTGS2、ESR1、HSP90AA1 对接，对接得分见表3。最低结合能越低说明靶蛋白与活性成分之间结合能力越好。以上结果表明ESR1、HSP90AA1 与槲皮素，山柰酚，木犀草素之间具有较强的结合能。PTGS2与槲皮素，山柰酚之间的结合较弱。以HSP90AA1为例，展示HSP90AA1 与3 个成分之间的结合如图7。

图7 HSP90AA1与槲皮素，山柰酚，木犀草素的分子对接图

表3 度值排名前3的化合物与主要靶点对接情况 kcal/mol

3 讨论

随着我国人民生活水平的提高，我国糖尿病的流行趋势不断攀升，据《糖尿病流行病学调查研究》分析，成人糖尿病患者约占人口11%，严重加重了医疗负担和患者的痛苦［11］。糖尿病足是糖尿病常见的并发症，已发展成一个非常严重的公共卫生问题［12］。自身的代谢管理、下肢运动康复治疗及手术等方式是目前控制糖尿病足的主要方案［13］，但进程并不理想。近年来，随着中医药不断进步发展，国家也在出台政策不断鼓励中医药的创新。有不少研究学者认为应用中药治疗糖尿病足有很好的治疗前景。Zhou 等［14］研究发现中药复方及相关药理活性成分对于促进糖尿病创面愈合有积极作用。

DFU 属于中医的“脱疽”范畴。“脱疽”其名记载在南齐龚庆宣《刘涓子鬼遗方》沿用至今［3］。脱疽常见“苦渴、数饮、身热”等为特征，其病机多以阴虚燥热为主，渐至痰瘀内结。如《证治准绳》曰:“饮食起居，一失其宜，皆能使血瘀滞不行，故百病由瘀血者多”［15］。因此，采用活血化瘀疗法可以 “截断扭转”，阻截疾病的恶化。对于不同类型的DFU 另可辅以清热解毒、化痰软坚、温补脾肾等法，遵照脱疽的分期，根据疾病的主次侧重，继而调和脏腑功能，通畅气血运行，扶正祛邪，从而起到治疗作用［16］。

活血化瘀方是我院经过多年实践探讨的宝贵结晶，综合多年临床经验在黄芪桂枝五物汤基础上，去白芍、生姜、大枣加三七、丹参、鸡血藤、牛膝、桑枝、甘草，从而创立益气活血、通络化瘀的“活血化瘀方”。在临床上已应用于糖尿病足的治疗，该方在延缓溃疡进程和促进溃疡愈合方面都有良好的进展。本次研究结合网络药理学及分子对接等现代科学方法，深入探讨活血化瘀方在DFU 方面的疗效。中医治疗代谢性疾病具有多成分、多靶点的特点，这与网络药理学的特点不谋而合。网络药理学如今已成为研究中医药药理基础及其中药作用疾病的作用机制研究的一个热门工具，在中药活性成分筛选、中医药多成分、多靶点、多通路的作用机制阐释等方面得到了广泛的应用［17］。

本研究利用网络药理学筛选活血化瘀方有效活性成分179 个，可作用于糖尿病足的治疗靶点205个。排名靠前有效成分分别是槲皮素、山柰酚和木犀草素这3 种黄酮类化合物，提示这些化合物可能是活血化瘀方干预糖尿病足的核心药效成分。有研究发现，槲皮素可以加快糖尿病大鼠难愈性伤口愈合，其机制与促进伤口部位血管新生、肉芽组织增生、胶原纤维沉积，减轻伤口炎症反应有关［18］。含有槲皮素壳多糖纳米粒在修复皮肤方面也有功效［19］。研究表明，山柰酚和木犀草素对糖尿病及其并发症的改善作用也很明显。

根据PPI 网络分析结果，发现PTGS2、ESR1、HSP90AA1 等为关键靶点。PTGS2 蛋白在前列腺素生物合成、脂肪酸生物合成、细胞运动性、生理过程、血压调控、环氧酶途径、角化细胞分化、调控炎症应答等方面发挥了重要作用。Estrogen receptor 是一种雌激素受体，研究发现它与女童糖尿病的发生发展密切相关［20］。其中，PTGS2 和HSP90AA1 也是中药复方益糖康防治糖尿病肾病的关键靶点［21］。而糖尿病肾病与DFU 病是糖尿病发生发展过程中的重要的并发症。本研究表明，活血化瘀方干预DFU 的核心靶点与PTGS2、ESR1、HSP90AA1 有关。

GO 功能富集和KEGG 通路富集结果显示活血化瘀汤治疗DFU 与细胞对氮化合物的反应、对无机物的反应和对异种生物刺激的反应活性等相关，可能与脂质和动脉粥样硬化，P13K-Akt 信号等通路有关。糖尿病病人中发生脂质和动脉粥样硬化的概率明显高于非糖尿病人，P13K-Akt 信号通路在糖尿病的治疗机制中研究甚多。在糖尿病肾病的研究中，P13K 的表达是增多的［22］。综合以上研究，我们可以得出活血化瘀方通过槲皮素、山柰酚和木犀草素等活性成分调控PTGS2、ESR1、HSP90AA1 等靶点基因，进而调控脂质和动脉粥样硬化，P13KAkt 信号通路起到治疗DFU 的效果。本研究中，分子对接表示槲皮素、山柰酚和木犀草素对ESR1、HSP90AA1 靶点的结合较好，木犀草素对PTGS2 的结合较好，为后续进一步实验验证和处方开发提供了方向。