蓟马取食诱导对紫花苜蓿次生代谢物含量及防御酶活性的影响

吴芳，师尚礼，康文娟，陈晓梅，阿芸，张辉辉，李自立

（甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070）

随着我国从“粮-经”种植结构到“粮-经-饲”种植结构的转变，草产业呈现出强劲的发展势头，被称为“牧草之王”的紫花苜蓿（Medicago sativa）种植面积也逐年增加。甘肃省作为紫花苜蓿生产的第一大省，紫花苜蓿种植面积占全国的1/3，尤其在金昌、张掖和酒泉等河西地区形成了苜蓿主产区［1］。然而，蓟马类害虫是紫花苜蓿主产区最常见的害虫之一［2-4］。调查发现为害紫花苜蓿的蓟马种类分别有牛角花齿蓟马（Odontothrips loti）、苜蓿蓟马（O.phateratus）、普通蓟马（Thrips vulgatissiums）、花蓟马（Frankliniella intonsa）、烟蓟马（T.tabaci）等，其中牛角花齿蓟马为优势种［5-8］。蓟马通过锉吸式口器主要将苜蓿的心叶、嫩叶等幼嫩组织的表皮挫破，引起叶片畸形、褪色，严重时卷曲发白，导致草产量损失、营养价值降低。此外，因蓟马个体微小、隐蔽性强、繁殖速度快、易产生抗药性，单一的杀虫剂难以取得理想的防治效果［9］。因此，选育抗蓟马苜蓿品种是防治该虫的重要策略和有效方法，而探索和挖掘紫花苜蓿自身形成的抗蓟马生理机制是抗虫育种的基础。

植物受到害虫为害后，其植株体内防御途径中的信号分子会诱导产生其下游化学防御物质，防御酶和某些次生代谢物会在极短的时间内迅速合成并大量积累，从而激活诱导型防御机制，增强自身抗性［10-12］。植物体内的黄酮、单宁和木质素等次生代谢产物能阻碍害虫取食，影响害虫生长、发育和繁殖，其含量与植物抗虫性密切相关［13-14］。王小珊［15］研究表明不同虫口压力牛角花齿蓟马为害后，抗蓟马苜蓿无性系R-1和感蓟马苜蓿无性系I-1叶片中的总酚、黄酮、缩合单宁和木质素含量均高于对照。骆桂芬等［16］和蒋桂华等［17］研究指出植物受到虫害或病害侵染时，可以诱导木质素含量升高。孙兴华等［18］研究表明黄瓜（Cucumis sativus）受南美斑潜蝇（Liriomyza huidobrensis）为害后，其叶片的黄酮和单宁含量随着为害程度增强而显著增加。吴岩等［19］研究发现木瓜秀粉蚧（Paracoccus marginatus）为害木薯（Manihot esculenta）前后，抗虫木薯品种的单宁含量均显著高于感虫木薯品种。以往的研究证实过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物次生代谢过程中的关键酶，它们在植物抵抗害虫方面起着重要的保护作用［20-21］。寇江涛等［22］研究指出蓟马为害后，抗、感蓟马苜蓿无性系R-I和I-1的POD、PAL和PPO活性升高可能是一种诱导抗性的表现。芦屹等［23］研究指出棉蚜（Aphis gossypii）取食胁迫后，抗蚜棉花品种的POD、PAL和PPO活性显著高于感蚜棉花品种。武德功等［24］研究指出随着玉米蚜（Rhopalosiphum maidis）密度的增加，玉米（Zea mays）抗蚜品种的PAL和PPO活性呈上升趋势。然而，蓟马取食诱导对不同抗蓟马紫花苜蓿品种次生代谢物质含量与防御酶活性的影响很少报道。

因此，本研究以3种不同抗蓟马紫花苜蓿品种为材料，研究不同蓟马头数为害对紫花苜蓿苗期的次生代谢物质（黄酮、单宁、木质素）含量和防御酶（POD、PAL、PPO）活性的影响，以期阐明蓟马为害紫花苜蓿的诱导型防御的生理机制，为筛选紫花苜蓿关键抗虫次生代谢物提供理论基础，为蓟马综合防治提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试虫源：甘肃农业大学校内牧草实训基地田间自然发生的蓟马成虫（牛角花齿蓟马为优势种）。

供试紫花苜蓿品种分别为抗蓟马紫花苜蓿品种甘农9号（M.sativacv.Gannong No.9）［25］、感蓟马紫花苜蓿品种甘农3号（M.sativacv.Gannong No.3）［4］和高感蓟马紫花苜蓿品种WL363HQ（M.sativacv.WL363HQ）［26］。甘农9号和甘农3号种子由甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室提供，WL363HQ由北京正道种子公司提供。

1.2 试验设计

1.2.1紫花苜蓿幼苗生长试验2020年6月至8月在甘肃农业大学牧草实训基地8 m×6 m×2 m的网室中进行。将营养土∶草炭土∶蛭石按比例2∶1∶1混合均匀，称取750 g装入花盆（高度为18 cm，直径为12 cm）中，将花盆的2/3埋入土中，置于田间环境条件下发芽和生长。将0.1% HgCl2消毒后的饱满、大小均匀的种子，播种于花盆中，出苗后每盆保留生长一致的5株幼苗。根据需要每隔2～3 d浇水1次，隔7 d浇灌100 mL/盆 Hoagland营养液，保证幼苗正常生长。为了排除蓟马及其他害虫，将紫花苜蓿幼苗保护在覆盖有60目防虫网的网室中。紫花苜蓿生长45 d后，开始接入蓟马成虫进行试验。

1.2.2试验设计试验采用随机区组试验设计，每个处理中3个品种随机摆放，每个品种4盆，相邻处理间的间距为50 cm，重复3次。紫花苜蓿每个枝条分别接种4头、5头、6头蓟马成虫，每个处理单独用60目防虫网罩住以防蓟马逃逸，对照组不接虫（CK），也罩上防虫网。由于蓟马体长1.5 mm或更小，接虫时尽量避免对蓟马的伤害。蓟马为害5 d后随机收集紫花苜蓿植株的叶片，迅速置于液氮中冷冻20 min，然后保存于超低温-80 ℃冰箱中，每个处理重复3次，用于测定次生代谢物含量、防御酶活性等。

1.3 测定指标

次生代谢物含量测定：黄酮含量采用亚硝酸钠—硝酸铝比色法测定［27］；单宁和木质素含量采用苏州格锐思试剂盒测定。

防御酶活性测定：过氧化物酶活性参照邹琦［28］的方法，采用愈创木酚法测定；苯丙氨酸解氨酶参照参考刘佳［29］方法测定；多酚氧化酶采用苏州格锐思试剂盒测定。

1.4 数据分析

利用Excel 2016整理数据并作图，采用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 蓟马取食诱导对不同抗蓟马性紫花苜蓿品种次生代谢物的影响

随着蓟马头数的增加，甘农9号的黄酮含量呈上升趋势，而甘农3号和WL363HQ的黄酮含量呈先增后减的变化趋势（图1）。蓟马取食诱导显著增加了供试紫花苜蓿品种的黄酮含量（P＜0.05），甘农9号的黄酮含量较CK分别提高了1.03%，2.86%，6.89%；甘农3号的黄酮含量较CK分别提高了4.16%，6.47%，5.71%；WL363HQ的黄酮含量较CK分别增加了3.09%，5.15%，4.17%。在6头/枝条处理下甘农9号的黄酮含量显著高于甘农3号和WL363HQ（P＜0.05），增幅分别为1.79%，2.13%。在4、5头/枝条处理下，供试紫化苜蓿品种的黄酮含量差异不显著。

图1 蓟马取食诱导后紫花苜蓿品种的黄酮含量Fig.1 The flavonoids contents of alfalfa cultivars after infecting by thrips

蓟马取食诱导显著增加了供试苜蓿品种的单宁含量（P＜0.05）（图2）。与CK相比，4头/枝条处理下甘农9号、甘农3号和WL363HQ的单宁含量增幅分别为74.18%，28.22%，35.18%，表明蓟马取食胁迫后甘农9号的单宁含量变化较甘农3号和WL363HQ敏感。甘农9号的单宁含量在5头/枝条处理下达最高（2.23 mg/g），较CK显著提高了83.75%；而甘农3号和WL363HQ的单宁含量均在4头/枝条处理下增至最高。相同蓟马头数取食诱导处理下甘农9号的单宁含量均显著高于甘农3号和WL363HQ（P＜0.05），较甘农3号提高了31.28%，53.49%，47.70%；较WL363HQ增加了34.06%，71.52%，58.60%。

图2 蓟马取食诱导后紫花苜蓿品种的单宁含量Fig.2 The tannin contents of alfalfa cultivars after infecting by thrips

蓟马取食诱导后供试苜蓿品种的木质素含量变化与单宁相似，均呈先增后减的变化趋势，且显著高于CK（P＜0.05）（图3）。与CK相比，甘农9号的木质素含量显著增加了16.14%，21.72%，18.16%；甘农3号的木质素含量显著提高了18.01%，15.90%，11.94%；WL363HQ的木质素含量增幅分别为16.45%，19.83%，15.82%（P＜0.05）。5、6头/枝条处理下，甘农9号的木质素含量显著高于甘农3号和WL363HQ（P＜0.05），较甘农3号和WL363HQ分别增加了5.60%，3.50%；6.13%，3.96%，但甘农3号和WL363HQ的木质素含量未达显著差异。

图3 蓟马取食诱导后紫花苜蓿品种的木质素含量Fig.3 The lignin contents of alfalfa cultivars after infecting by thrips

2.2 蓟马取食诱导对不同抗蓟马苜蓿品种防御酶活性的影响

甘农9号、甘农3号和WL363HQ的POD活性随着蓟马头数的增加呈上升趋势，且显著高于CK（P＜0.05）（图4）。与CK相比，蓟马取食诱导后甘农9号的POD活性增幅分别为3.44%，14.42%，28.76%；甘农3号的POD活性增幅分别为10.91%，15.09%，26.32%；WL363HQ的POD活性增幅分别为12.24%，13.99%，26.74%（P＜0.05）。相同蓟马头数处理下供试苜蓿品种的POD活性存在显著差异（P＜0.05）。WL363HQ的POD活性在4头/枝条处理下较甘农9号和甘农3号分别显著提高7.47%，3.44%；而5和6头/枝条处理下甘农9号的POD活性较甘农3号和WL363HQ分别显著增加2.60%，1.36%；5.19%，2.58%（P＜0.05）。

图4 蓟马取食诱导后紫花苜蓿品种的POD活性Fig.4 POD activities of alfalfa cultivars after infecting by thrips

随着蓟马头数的增加，甘农9号的PAL活性呈持续上升趋势，甘农3号和WL363HQ的PAL活性呈先升后降的变化趋势（图5）。与CK相比，蓟马取食诱导显著提高了供试苜蓿品种的PAL活性（P＜0.05），甘农9号PAL活性的增幅分别为16.40%，22.12%，26.37%；甘农3号PAL活性的增幅分别为8.99%，31.60%，25.88%；WL363HQ的PAL活性增幅分别为6.98%，14.94%，10.77%。4、5和6头/枝条处理下甘农9号的PAL活性均显著高于甘农3号和WL363HQ（P＜0.05），较 甘 农3号 分 别 提 高 了16.35%，1.09%，9.36%；较WL363HQ分别增加了6.04%，3.54%，11.18%（P＜0.05）。

图5 蓟马取食诱导后紫花苜蓿品种的PAL活性Fig.5 PAL activities of alfalfa cultivars after infecting by thrips

供试苜蓿品种的PPO活性随蓟马头数的增加均呈下降趋势，且显著低于CK（P＜0.05）（图6）。与CK相比，甘农9号的PPO活性分别显著降低了13.59%，22.63%，25.66%；甘农3号的PPO活性分别显著减少了12.63%，23.43%，24.58%；WL363HQ的PPO活性分别显著下降了12.04%，16.87%，41.25%（P＜0.05）。4、5头/枝条处理下WL363HQ的PPO活性较甘农9号分别显著增加了3.18%，8.91%，较甘农3号分别显著提高了5.49%，13.76%（P＜0.05）；而6头/枝条处理下甘农9号的PPO活性较甘农3号和WL363HQ分别显著提高了1.89%，24.84%（P＜0.05）。

图6 蓟马取食诱导后紫花苜蓿品种的PPO活性Fig.6 PPO activities of alfalfa cultivars after infecting by thrips

3 讨论

昆虫取食诱导是植物防御系统启动的重要诱因。昆虫口腔分泌物中的诱导子使植物对危害信号进行识别，进而启动防御系统产生诱导抗性，如通过 POD 、PAL、PPO及 LOX等多种防御酶的催化，诱导植物体内酚类、生物碱、萜类等多种有毒次生代谢物质的积累，从而直接或间接提高抗虫能力［30-32］。酚类物质是高等植物中普遍存在的次生代谢产物，其中黄酮是一类对昆虫有毒的酚类物质，可以影响昆虫的取食，延缓昆虫的生长发育，严重时导致昆虫中毒甚至死亡［33］。张华峰［34］研究表明随着松墨天牛（Monochamus alternatus）为害程度的加剧，马尾松（Pinus massoniana）针叶的黄酮含量呈先上升后下降的变化特点。马荣金等［35］研究指出不同抗性黄瓜（Cucumis sativus）材料被蚜虫侵染后，黄酮含量呈先增后减的变化趋势。本研究发现抗蓟马苜蓿品种甘农9号的黄酮含量呈上升趋势且显著高于CK，而感蓟马苜蓿品种甘农3号和高感蓟马苜蓿品种WL363HQ的黄酮含量呈先升后降趋势，说明甘农9号合成的黄酮较甘农3号和WL363HQ多，从而对蓟马的取食产生不利影响，抵御了蓟马为害，因此甘农9号表现出良好的抗性。

单宁被认为是一类有效的防御化合物，它主要干扰昆虫的肠道消化、抑制多种消化酶的活性，破坏昆虫的正常代谢，从而影响昆虫对食物的利用［36-37］。贾彦霞等［38］研究指出5个辣椒品种叶片的单宁含量随西花蓟马（F.occidentalis）取食诱导表现为先升后降的变化特点，抗性品种74-82和娇龙的单宁含量显著高于其他品种。本研究结果表明，蓟马取食诱导显著提高了供试苜蓿品种的单宁含量，这与贾彦霞等［38］的研究结果一致，即抗蓟马品种甘农9号的单宁含量显著高于甘农3号和WL363HQ。王小珊等［39］研究表明牛角花齿蓟马（O.loti）为害后，抗蓟马苜蓿R-1和感蓟马苜蓿I-1叶片的木质素含量均升高，且R-1的木质素含量增加率均高于I-1。蔡冲等［40］研究指出烟粉虱（Bemisia tabaci）胁迫9 h后番茄抗虫品种（Hongshengnv，HSN）的叶片木质素含量显著高于感虫品种（Huangshengguo，HSG）。在本研究中，蓟马取食诱导后，供试苜蓿品种的木质素含量显著增加，表明受害叶片细胞壁木质化增加、机械组织增强。当每枝条超过4头蓟马时甘农9号的木质素含量显著高于甘农3号和WL363HQ，这与王小珊等［39］和蔡冲等［40］的研究结果一致。本研究说明蓟马取食诱导可诱导苜蓿叶片中黄酮、单宁和木质素含量增加，该结果为进一步揭示寄主植物苜蓿与蓟马之间的防御机制提供了基础。

过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）是植物在生物胁迫和非生物胁迫的防御酶，POD参与木质素的合成，PAL参与黄酮、单宁和木质素等的合成和积累，PPO可促进多酚的合成［41-43］。He等［44］研究发现在接种蚜虫的早期，菊花（Dendranthema morifolium）3个品种通过提高PAL和PPO活性来对蚜害做出快速响应。沈登荣等［45］研究表明端大蓟马（Megalurothrips distalis）取食胁迫显著提 高 了 菜 豆（Phaseolus vulgaris）、豇 豆（Vigna unguiculata）和蚕豆（Vicia faba）的POD活性。本研究发现蓟马取食诱导后不同抗蓟马苜蓿品种的POD和PAL活性显著上升，而PPO活性显著下降。此外，当蓟马头数超过4头/枝条时，抗蓟马苜蓿品种甘农9号的POD和PAL活性显著高于感蓟马苜蓿品种甘农3号和高感蓟马苜蓿品种WL363HQ，说明随着蓟马为害程度的加剧，POD和PAL活性增强可诱导木质素、黄酮的大量合成，有助于提高甘农9号的抗性。然而，植物诱导型防御是一个复杂的过程，从植物诱导防御的整体性和系统性方面考虑，蓟马对诱导次生代谢物质的代谢通路有待于进一步研究。

4 结论

随蓟马头数的增加，甘农9号的黄酮含量、POD和PAL活性呈持续增加趋势，单宁和木质素含量呈先升后减的趋势，PPO活性呈下降趋势；而甘农3号和WL363HQ的POD和PAL活性呈上升趋势，黄酮、单宁和木质素含量均呈先增后减的变化特点，PPO活性不断下降。此外，5和6头/枝条处理下甘农9号的单宁、木质素含量和POD、PAL活性均显著高于甘农3号和WL363HQ，因而甘农9号表现出较强的抗性。