透明质酸的生物合成及其代谢工程的研究进展

马艳琴 邱益彬 李莎 徐虹

（1. 南京工业大学食品与轻工学院，南京 211816；2. 南京林业大学轻工与食品学院，南京 210037）

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种由β-1，3-N-乙酰基-D-葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）和β-1，4-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcUA）的双糖单位聚合而成的线性大分子酸性黏多糖［1］（图1）。HA分子内不含硫酸基团，也不与蛋白形成共价化合物，在溶液里HA以游离的自由链或无规则卷曲的形式存在。HA作为细胞间质的重要组成成分，在维持着皮肤的功能、形态、结构当中起着不可或缺的作用，在亚洲HA产品主要在化妆品中添加，用于保湿、防皱以及延缓肌肤衰老。同时HA无色无味、易溶于水、不改变产品本来的性质，被批准为新的食品原料，可作为食品原料添加到各类应用中，前景十分广阔。目前HA主要是通过微生物发酵获得，但随着对HA发酵研究的深入，同样也面临了一些新的挑战。首先，当采用以兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）为主的野生型链球菌进行HA发酵生产时，链球菌属自身存在一定的安全问题且所要求的发酵条件十分苛刻［2-3］。在HA生物合成过程中，第二个比较突出的问题就是糖前体底物和HA产物之间不平衡的问题。HA合成的两个前体UDP-GlcUA和UDPGlcNAc同时也是用于菌体细胞壁生物合成的前体，因此菌体自身的细胞生长和HA合成存在底物的竞争［4］。此外，除了用于细胞的生长，HA合成过程中乳酸和乙酸等副产物的产生需要消耗约80%的碳源［5］，严重影响了HA底物的利用。第三，HA在宿主中合成过程伴随着大量氧化还原过程，该发酵是严格需氧的过程，但随着HA在发酵液中不断积累，其高分子粘性会使发酵液溶氧降低，这对HA合成过程十分不利。第四，HA合成酶（HAS）是膜结合蛋白，自身需要通过多达7种不同的功能来启动、延长和分泌HA［6］，因此膜结构和HAS氨基酸序列是影响HA合成的重要因素。本文从分子生物学角度对近年来HA生物合成中遇到的问题和采取的有效策略进行梳理和总结，为未来HA的高效合成研究提供参考。

图1 N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的重复HA双糖单元分子结构Fig. 1 Molecular structure of repeating HA disaccharide unit composed of N-acetylglucosamine and glucuronic acid

1 HA合成途径及关键合成酶

HA在细胞内合成过程中需要有多种酶的参与（图2），无论真核生物还是原核生物，HA的合成都是以单糖为起始，通过三羧酸循环和磷酸戊糖途径形成D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcUA）和N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）两个单糖底物，再通过关键酶HAS使两个底物连接成HA的结构单元，将逐渐变长的糖链释放到胞。在众多酶中，hasB基因负责编码UDP-葡萄糖脱氢酶，hasC基因负责编码UDP-葡糖焦磷酸化酶，另一边glmU编码UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，glmM编码磷酸葡萄糖异构酶。与天然合成HA菌株相比，目前所涉及的诸如枯草芽孢杆菌等基因工程菌中，主要缺乏使HA前体UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的聚合关键基因hasA。

图2 HA在微生物中合成的代谢通路Fig. 2 Metabolic pathways of HA synthesis in microorganisms

自从发现和克隆了第一个编码化脓性链球菌透明质酸合成酶（HAS）的基因（sphasA）后，类似的HA合成酶基因（或cDNA）已经在哺乳动物（人和老鼠）、青蛙、感染藻类的病毒中被发现［7-11］。这些不同的HASs酶组成了一个具有氨基酸序列同一性或相似性的区域的蛋白质大家族。根据氨基酸序列同源性和拓扑结构，已知的HAS蛋白被分为I类和II类，来自多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）的PmHAS［12］是唯一的II类成员，I类酶来源则包括链球菌S. pyogenes（SpHAS）、S. equisimilis（SeHAS）［13］、S. zooepidemicus（SzHAS）［14］、S. parauberis（SpaHAS）［15］和S. uberis（SuHAS）［16］以 及 病 毒PBCV-1（CvHAS）［11］和 脊 椎 动 物［17-18］来 源 的HAS1-3酶［6］。目前研究最多的几种HAS氨基酸序列对比如图3。动物和细菌来源的has基因同源性为56%，其中几种链球菌属的has基因同源性为62%，而动物之间的has基因同源性高达93%。不同来源HAS蛋白的氨基酸序列有保守区域，这些保守序列为HA合成的关键区域。在大多数无HA合成的微生物中，只需要引入单基因has即可实现HA的异源合成，例如在毕赤酵母中利用非洲爪蟾的透明质酸合成酶（xlHasA）成功合成了高分子量HA［19］，Gomes等［20］首次在乳酸克鲁维酵母中将多杀性巴氏杆菌的hasA基因与非洲爪蟾的hasB基因相结合进行HA合成表达。

图3 不同来源的透明质酸合成酶的多序列比对图Fig. 3 Multiple sequence alignment of hyaluronidases from different sources

HASs是一种膜结合蛋白（图4），Wang等［21］发现seHasA和spHasA具有不同HA合成能力，为了进一步探索原因，用spHasA的相应跨膜螺旋Thr7-Met25取代了seHasA上对应的第一个跨膜螺旋Leu7-Val25，从而产生seHasAThr7-Met25。突变体seHasAThr7-Met25在谷氨酰胺中的表达水平与野生型seHasA相同，然而其产生的HA量却要高得多，这表明I型HA合成酶的第一个跨膜螺旋在调节HA合成中起关键作用。

图4 微生物中HA合成酶跨膜蛋白流动镶嵌模型Fig. 4 Flow mosaic model of HA synthase transmembrane protein in microorganisms

2 透明质酸的生物合成及生物学改造

2.1 基于GRAS菌株的HA合成

目前，HA的商业化生产主要依赖于A组链球菌的发酵，这些天然链球菌属生产HA的研究大部分着眼于物化环境对其生产的影响［5，22-23］，且其潜在的致病高风险和产品中外毒素的污染限制其更广泛的应用。尽管通过敲除HA天然生产菌毒力基因的方法能降低菌株毒力，但并不能完全消除，且相关基因过多操作复杂难以实现。基因工程和代谢工程等实现了从非致病的、安全的微生物中获得HA，目前HA已经被广泛的异源宿主产生。人们已经设计了许多公认的安全（GRAS）菌株如枯草芽孢杆菌［24-27］、乳酸乳球菌［28-29］、谷氨酸棒杆菌［30-32］和毕赤酵母［19］等为HA的替代性生产菌。这些菌株共同的特点是相对安全且遗传背景清晰、具有成熟的DNA操作技术、对生长环境及营养条件要求不高、具有表达高活性蛋白酶和高分子聚合的能力等。在研究最多的重组枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌中的HA产量和分子量分别达到6.8 g/L、4.55×106Da［24］和34.2 g/L、3.31×105Da［21］。各种工程菌合成HA产量及分子量比较见表1。

表1 不同工程菌生产透明质酸的产量Table 1 Yield and molecular weight of hyaluronic acid produced by different hosts

2.2 强化HA合成前体途径

HA的合成通过两条不同的合成路径，两个前体UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc在HAS酶的催化下交替聚合成链（图3）。在大多数细菌中，UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc同时也是用于细胞壁生物合成的前体，由此前体浓度与HA产量正相关，通过前体途径优化可以提高HA产量。Streptococcus thermophilus中同时过表达hasA和hasB菌株HA产量是野生型菌株的6倍［4］。Widner等［25］将马链球菌的hasA透明质酸合酶编码基因在枯草芽孢杆菌中表达，产生1.1-1.2 MD范围的HA，并且同时过表达hasA基因与内源性tuaD基因可高水平生产HA。随后Chien等［45］也证实尽管在枯草芽孢杆菌基因组中仅表达hasA可以实现HA的异源生产，但hasB或tauD与hasA的共表达可将HA的产量提高至少2倍。Jia等［24］通过两步诱导法在枯草芽孢杆菌中引入巴氏杆菌HAS（pmHAS）基因和前体tuaD-gtaB操纵子，最终获得了产量6.8 g/L、分子量达到4.5 MD的HA。然而在谷氨酸棒状杆菌中，关于UDP-GlcUA前体途径的强化结果却不同，Cheng等比较发现操纵子hasA-hasB更适合在重组C. glutamicum中合成HA［30］，同样的结论也在乳酸乳杆菌中得到了证实［28-29］。

为了探索另一前体UDP-GlcNAc对HA合成的影响，Jin等［26］在B. substills中也做了相关研究，发现在单独强化UDP-GlcNAc途径中，同时过表达3个相关基因glmU、glmM和glmS对HA产量的提升最大。并且在过表达tuaD-gtaB的同时，强化glmU、glmM和glmS的表达能使HA产量达到最大值，同时也证实中间体UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的浓度和比例是控制HA分子量的关键因素［50］。综上所述，上调UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc都能使HA在工程菌中的积累增加，值得注意的是UDP-GlcNAc途径中相关基因表达的比例对HA分子量有很大影响，这些结果对工程菌高产HA都有十分重要的意义。

2.3 基于HA合成中碳通量分布的代谢改造

微生物生产HA会与生物生长、糖酵解和磷酸戊糖途径一起竞争碳源。果糖-6-磷酸是糖酵解途径和HA合成的关键中间体，果糖-6-磷酸激酶由pfkA编码，是糖酵解途径中的第一个限速酶［51］，在正常条件下，果糖-6-磷酸主要流向到EMP途径。Zhang等［35］在链霉菌中通过高效表达蔗糖-6-磷酸激酶基因scrB并敲除磷酸转移酶基因fruA和磷酸果糖激酶基因fruK后，HA产量分别增加了22%和27%。Jin等［26］利用Cre/lox系统［52］将pfkA（编码6-磷酸果糖激酶）的起始密码子ATG替换为TTG或GTG［27］，以适度下调pfkA的表达，从而为HA的合成提供更多的果糖-6-磷酸，重组B. substills168中HA的产量分别增加了13%和18%。乳酸是丙酮酸前体在乳酸脱氢酶（LDH）催化下的副产物，浪费了合成HA等目标产物所需的能量和前体。为了满足HA合成所需的能量需求，在乳酸乳杆菌中，移除乳酸脱氢酶重新分配了碳流和氧化还原平衡，HA的产量提高了3倍［53］。Cheng等［32］也在谷氨酸棒状杆菌中通过单交叉同源重组敲除乳酸脱氢酶（LDH）基因，阻断了产生乳酸的代谢途径，获得了HA产量显著提升的工程菌。

另一方面，合适的启动子选择对于高效合成HA也是非常重要的。在重组谷氨酸棒状杆菌中，强或中等强度的组成型启动子对HA的产生效果不佳。这在一定程度上与HA合成的底物也是产生磷壁酸和肽聚糖必不可少组分的理论吻合。诱导型启动子Ptac以IPTG为诱导剂，通过控制HAS表达的时间能有效地驱动hasA-hasB操纵子在谷氨酸棒状杆菌中的过表达［30］。如果过早添加IPTG（例如在培养0 h时），则Ptac效果不佳。因此通过表达质粒的转录时机调控，也是缓解菌体生长与HA合成竞争关系的又一有效手段，

2.4 HA合成中氧化还原反应的生物学改造

为了补充HA生物合成所消耗的能量，Chien等［45］将透明颤藻血红蛋白（VHb）与合成HA的基因共表达。随着vhb的表达，不仅细胞浓度提高了25%，HA产量也进一步提高了100%，这可能是由于vhb的表达增加了ATP的利用率。培养30 h后，携带vhb，hasA和tuaD表达盒基因的重组枯草芽孢杆菌获得了约1.8 g/L的HA。共表达血红蛋白基因vgb的谷氨酸棒状杆菌与不表达vgb的培养物相比，HA生产菌具有了更高的CDM，虽然vgb的共表达使枯草芽孢杆菌的HA产量增加了一倍，但降低了谷氨酸杆菌的HA产量［31］。这可能是因为谷氨酸杆菌的中枢代谢调控、碳分解代谢抑制模式和基因表达调控与枯草芽孢杆菌不同［54］，氧气供应的改善将代谢流重新定向到细胞生长和能量生成上，并降低了谷氨酸杆菌中HA的产量。当谷氨酸杆菌细胞缺氧时，它们停止生长，但保持代谢活性，并保持其从葡萄糖中产生大量产物的能力。

另一方面细胞内的氧化环境影响了HA的合成［55］，这种氧化环境一方面通过NAD+/NADH的比值体现，HA的产量与之成正比。而NAD+/NADH的动态平衡通过氧化还原感受器和Rex等转录调节因子在细胞内介导［56］。Prasad等［57］发现在兽疫链霉菌中hasB的转录水平比其他HAS基因低好几倍，在乳酸链球菌中即使过表达hasB基因，NAD+/NADH比值较较低时，在热力学上也不利于HA的产生［51］。通过Rex结合位点的筛选和基因表达与NAD+/NADH比值的相关性，他们也间接证明了Rex对几个关键基因转录调控的可能性。HA作为多糖高分子，在发酵生产时粘度严重影响了菌体的氧摄入，为了克服物理溶氧（dissolved oxygen，DO）带来的瓶颈，Jin等［26］将来源于水蛭的透明质酸酶LHAase导入B. subtilis168中。并通过人工设计的RBS调控元件精确控制LHAase的表达水平，生产低分子量的HA（LMW-HA）的同时，HA产量提升了37%。

2.5 强化HA合成及转运

目前用于原核工程菌的HAS都是来自链球菌属的I类蛋白，其HAS蛋白需要通过多达7种不同的功能来启动和延长HA链，并将其挤出跨膜结构最后产生HA［6］。为了研究HAS酶的工作机制，Zhang等［58］通过改变兽疫链球菌HAS（SzHAS）胞内结构域的5个区域，并在枯草芽孢中表达获得了更高的HA效价和分子量。由于分泌型HA能包裹谷氨酸棒状杆菌，改变其细胞形态并抑制新陈代谢，Wang等［21］发现用水蛭透明质酸酶破坏包膜可以恢复菌体新陈代谢，产生74.1 g/L的低分子透明质酸。另一方面兽疫链球菌在生产高分子量透明质酸（HA）方面具有巨大的潜力，但透明质酸酶对HA的降解阻碍了该细菌在高分子量情况下提高HA产量。Yan等［52］利用同源重组技术敲除了野生菌中的透明质酸酶，最终HA分子量从1.5 MD提高到3.8 MD。这些研究可以发现HAS合成酶与HA降解酶的综合利用，可以提高HA合成与转运，亦可产生不同分子量维度的HA。

膜的有效表面积可以显著影响膜蛋白的折叠和产量，而HAS是一种膜结合蛋白（图2），细胞膜的表面积会影响单细胞的HA合成能力。Westbrook等［59］利用枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9工具［60］，通过CRISPR干扰（CRISPRi）降低了FtsZ（启动细胞分裂）的表达，从而改变了心磷脂（cardiolipin，CL）在膜中的分布，提高了摇瓶培养中的HA滴度和分子量。为了进一步增强SeHAS的表达，随后通过过表达磷脂酰甘油磷酸合酶基因pgsA和心磷脂合成酶基因clsA增加细胞膜CL含量，使HA滴度增加204%，最大分子量增加到2.2 MD。该膜工程研究还分别使ppsA和ugpP失活，将磷脂酰乙醇胺（PE）和中性糖脂（GL）从枯草芽孢杆菌的膜上去除，这一突变并不能显著改变枯草芽孢杆菌HA的生产，因为PE可以提高seHAS的活性而UgpP参与了脂磷壁酸的膜锚定。这一研究表明枯草芽孢杆菌膜上存在的其他主要脂质（即PE和GL）对维持seHAS的活性起关键作用。综上所述seHAS的功能表达是依赖于脂质的。

这些与细胞生长、细胞伸长或细胞分裂的靶基因还与细胞形状相关，因此细胞形态工程可以受细胞分裂和细胞伸长过程的调控。除了细胞分裂相关的蛋白FtsZ，DivIVA是谷氨酸棒状杆菌细胞伸长过程中必不可少的蛋白，DivIVA和FtsZ表达的降低和增强均显著改变了谷氨酸棒状杆菌的细胞形态，使其由天然短杆状转变为小椭圆形（DivIVA降低）、球状（DivIVA增强）、长杆状（FtsZ降低）和哑铃状（FtsZ增强）。而引入HA合成途径后，只有FtsZ的过表达使细胞形态发生了惊人的变化，细胞膜面积增加了5.2倍，变成了粗长的杆状，同时HAS在膜上的表达增加了2.1倍，最终使单细胞的HA合成滴度提高了13.5倍［61］。但无论DivIVA和FtsZ的表达上调或下调，细胞形态的改变都会影响细胞分裂，从而减少细胞数量，相应地降低HA总滴度。通过优化两阶段诱导、引入动态代谢调节等合成生物学新方法［62-65］，消除形态调控对细胞生长的影响，有望进一步提高工程细胞的HA总产率。

3 总结与展望

目前许多诸如B. subtilis、C. glutamicum等非HA产生菌通过导入has基因可以很容易地转化为HA产生菌，工程菌生产代谢HA的过程中所面临的诸多挑战需要专门研究来增加对HA最佳生产条件的了解，在较为熟悉的基因工程菌株中异源表达合成HA的方法将会更加成熟和简单。随着对HA研究的不断深入，越来越多的研究表明HA的生物学功能与其分子量（molecular weight，MW）大小有着密切的关系。高分子量HA（MW≥1.0×106Da）由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应和润滑等功能，可用于关节腔注射恢复关节组织的黏弹性和修复软骨退变。相比于高分子量HA，低分子量HA（MW≤1.0×104Da）则更容易被人体吸收，常用于整形美容和化妆品，能促进伤口愈合和术后防粘连等。近年来，低分子HA（MW≤1.0×104Da）在食品保健以及医药领域同样展现出了重要的应用前景。研究表明，低分子HA在慢性伤口愈合和HA交联物的开发方面具有重要作用［66］。寡糖HA10（10糖单位）和HA8可以刺激胶原合成、成纤维细胞增殖、以及通过破坏大分子HA与细胞受体的相互作用而选择性杀死癌细胞［67-68］；而HA6和HA4可以诱导体内树突细胞的成熟以及新血管合成等［69］（表2）。

表2 透明质酸应用及对应分子量总结Table 2 Summary of hyaluronic acid applications and corresponding molecular weights

HAS在调控HA分子量方面起着至关重要的作用。Weigel等［82］用基因定点突变技术对SeHAS中的4个Cys进行突变，发现当Cys262和Cys281突变为Ala时，HA分子量降低了13%和28%。于慧敏等人进一步对SeHAS中C端的参与稳定HASeHAS复合物的R406-R413残基进行分析，实验表明SeHAS的C-末端与HA之间的结合亲和力会影响产物HA分子量的大小［83］。尽管过去针对HAS聚合酶做了大量突变工作来探究其在HA分子量调控中的关键位点，但这些突变位点所在的酶结构域中并不存在共性，这为进一步解析HAS分子量催化机制带来了困难，同时由于缺乏HAS结构特征，研究学者们仍未将HAS分子量调节机制阐释清楚。在未来，利用HAS的蛋白质工程以及HAS蛋白序列中自然存在的差异或可实现HA的分子量调控。