核糖核酸5′端NAD+帽子修饰研究进展

董海娇 杨晓玉 莫蓓莘 陈雪梅 崔洁

（1. 深圳大学生命与海洋科学学院，深圳 518037；2. 深圳大学光电工程学院 光电子器件与系统（教育部/广东省）重点实验室，深圳 518060；3. 山东农业大学园艺科学与工程学院，泰安 271018；4. 美国加利福尼亚大学河滨分校整合基因组学研究中心/植物科学系，美国加州河滨 92521）

核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）分子同时具有信息分子和调控分子的双重身份，在生命活动的各个方面发挥着重要作用。它种类繁多，主要包括经典的信使RNA（messenger RNA，mRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）和转运RNA（transport RNA，tRNA），以及近年来陆续被发现和报道的、具有基因表达调控作用的微小RNA（microRNA，miRNA）和具有免疫和防御功能的小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）等［1-2］。随着技术的更新和研究的深入，RNA在不同生物学过程中的功能和作用机制逐渐被揭示。

RNA功能的发挥主要由其自身序列和结构特征所决定，同时基于共价化学修饰的表观转录组（epitranscriptome）调控也发挥了重要的作用［3］。目前，在RNA分子上已鉴定到超过170种化学修饰，它们发生在长链分子内部或者两端，且多见于tRNA和rRNA上［4］。mRNA分子内部常见的碱基修饰有N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）和假尿苷（pseudouridine，Ψ）化等，它们在mRNA的稳定性、内含子剪切、输出、翻译等生物学过程中发挥着重要的调控作用［5］。其中，mRNA的m6A修饰是近年的研究热点，该过程的异常会导致动植物发育异常和疾病的出现，如胚胎发育迟缓和肿瘤等［6-7］。

7-甲基鸟嘌呤（7-methylguanosine，m7G）是真核生物mRNA 5′端特有的、经典的加帽修饰，参与调控mRNA的稳定性、加工、运输和翻译等生物学过程，具有重要的生物学意义［8-9］。不同于真核生物，传统观点认为原核生物mRNA 5′端以三磷酸RNA（pppRNA）为主，没有类似m7G的帽子结构［10］。但是2009年，研究人员利用液相色谱-质谱联用仪（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）对细菌RNA的5′端进行分析，鉴定到两种新的共价修饰，即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）和辅酶A衍生物（dephosphocoenzyme A，DP-CoA），并且NAD+帽子修饰的RNA（NAD-RNA）占比更高［11-12］。随后，人们陆续在酵母、小鼠、人源细胞、拟南芥等真核生物中也发现了NAD-RNA［13-14］，暗 示RNA的NAD+加 帽 是 一种非常保守的修饰机制。近年来，研究人员整合酶处理捕获和高通量测序技术（NAD captureSeq），实现了全转录组水平的NAD-RNA鉴定［15-16］，为随后NAD-RNA生物学功能及NAD+修饰代谢通路的研究奠定基础。

NAD+又称辅酶Ⅰ，是生物体内多种脱氢酶的辅酶，可把代谢过程中由脱氢酶催化产生的氢离子传递给黄素蛋白，从而将三羧酸循环和呼吸链反应串联起来［17-18］。而NAD+作为一种全新的RNA 5′端修饰结构，从最初发现至今仅有十几年的时间，特别是在真核生物中，NAD-RNA的鉴定和研究刚刚起步。本文聚焦于NAD-RNA，从其发现、检测技术的发展、生物学功能及其调控机制等方面对目前该领域取得的最新进展进行总结，并对今后的研究做出展望。

1 NAD-RNA的发现及其检测技术的发展

NAD-RNA最早发现于大肠杆菌（Escherichia coli）和委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）体内。2009年，研究人员利用分子排阻色谱（size-exclusion chromatography）分离E. coli和S. venezuelae的大分子RNA片段，然后以核酸酶P1将其消化为小分子片段，通过高分辨率LC-MS对这些小分子片段进行分析，首次检测到了位于RNA 5′端的NAD+帽子修饰［11］。Grudzien-Nogalska等［19］在此基础上提出通过两步法来检测NAD-RNA的含量，即“NAD-capQ”（NAD cap detection and quantitation）法，主要包括NAD-RNA的核酸酶P1处理和游离的NAD+含量的比色法检测。目前，NAD-capQ已成功应用于大肠杆菌、酵母、人源细胞HEK293T和拟南芥中NADRNA的定量检测［14，19］。最近，Wang等［13］结合offline HPLC（high performance liquid chromatography，高效液相色谱）和LC-MS/MS开发了可富集定量各种RNA帽子结构的CapQuant检测法，并在登革热病毒、大肠杆菌、酵母、小鼠肝脏和肾脏以及人源B淋巴细胞的mRNA中鉴定到包括m7G、NAD+在内的26种帽子修饰，也表明NAD+同m7G一样存在于mRNA的5′端。

NAD+及其代谢衍生物可参与生物体内多种基础的生理活动，在调控细胞氧化还原稳态、蛋白翻译后修饰以及信号转导等过程中发挥着重要作用，其含量异常可导致多种疾病的发生［20-21］。NADRNA是否参与上述过程，或者与其它未知的代谢和调控途径有关呢？为了解答上述问题，研究人员开发了NAD captureSeq，利用腺苷二磷酸核糖环化酶（adenosine diphosphate-ribosylcyclase，ADPRC）在炔醇存在条件下催化RNA 5′端NAD+发生转糖基化反应生成炔烃RNA（alkyne-RNA），随后通过铜催化的炔叠氮化物环加成（a copper-catalysed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC）反应将alkyne-RNA转化为生物素标记的RNA（biotin-RNA）（图1-A），最后借助链霉亲和素磁珠分离biotin-RNA并进行高通量测序，实现了在全基因组水平上对E. coli体内NADRNA的分析和鉴定［15］，结果表明，E. coli中NADRNA大多为特异的调控类小RNA（small RNA，sRNA）和mRNA［15］。随后，研究人员利用NAD captureSeq先后在酵母、人源细胞、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和拟南芥中鉴定NAD+加帽修饰的RNA［14，22-24］；与E. coli的研究结果类似，这些物种中的NAD-RNA主要是mRNA，另有少量的非编码RNA，表明NAD+是一种普遍存在的RNA修饰类型，且与m7G一样主要修饰mRNA，但可转录生成NAD-RNA的基因数目要少于转录生成m7G-RNA的基因数目。对大肠杆菌、酵母、小鼠和拟南芥中NAD-RNA生成基因的GO（gene ontology）分析结果显示，这些基因编码的蛋白主要涉及信号转导、转录相关过程、蛋白翻译及非生物胁迫响应如冷、热、旱、盐、ABA、营养缺失等［14-15，24-29］。

图1 NAD-RNA的CuAAC（A）和SPAAC（B）反应示意图Fig. 1 Schematic diagram of CuAAC（A）and SPAAC（B）reactions of NAD-RNA

尽管NAD captureSeq为人们鉴定NAD-RNA提供了有力的技术保障，但其仍存在一些缺陷。首先，在捕获NAD-RNA的CuAAC反应中，二价铜离子（Cu2+）的存在会导致一定程度的RNA降解，从而引起链霉亲和素磁珠富集的RNA片段呈现一定的5′端偏好，这不利于对NAD-RNA全长转录本序列信息的了解以及其转录水平的计算；此外，该方法存在一定程度的假阳性，近期有研究表明CuAAC反应对真核生物m7G-RNA亦存在微弱的转化能力，导致捕获到的RNA分子中存在一定量的m7G-RNA。为了克服上述问题，Hu等［26］在2021年提出了SPAAC-NAD-seq，用以鉴定拟南芥中的NAD-RNA；该方法首先利用anti-m7G抗体特异去除拟南芥mRNA中的m7G-RNA，然后通过不依赖Cu2+的应变促进的炔叠氮化物环加成（strainpromoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC）反 应体系（图1-B），捕获NAD-RNA并进行二代测序分析。与NAD caputureSeq相比，SPAAC-NAD-seq避免了m7G-RNA和Cu2+的干扰，因此大大提高了NAD-RNA鉴定的准确性和灵敏度。除此以外，Zhang等［28-31］在2019年和2021年先后利用CuAAC和SPAAC反应处理拟南芥和大肠杆菌RNA样本，然后在NAD-RNA的5′端连接一段合成的RNA标签（tagRNA）作为接头（adaptor），进一步富集含接头的NAD-RNA并通过Oxford Nanopore sequencing三代测序完成对NAD-RNA转录本信息的鉴定。相比NAD caputureSeq和SPAAC-NAD-seq，该策略省去了传统illumina测序中的RNA片段化、cDNA合成、PCR扩增和片段筛选步骤，进一步简化了NADRNA测序流程。以上全基因组水平的测序研究结果均表明，NAD+加帽修饰主要发生于部分编码蛋白的mRNA和部分具有特异调控功能的sRNA，其中真核生物中NAD+-mRNA主要来源于核基因，少数来源于线粒体基因，并为研究其具体的生物学功能奠定基础。

2 NAD+帽子对RNA转录后调控的影响

已有研究结果表明，真核生物中NAD+修饰的基因大多亦可被m7G加帽［14，23］。NAD+帽子是否和m7G一样，能够保护RNA不被降解、招募相关蛋白参与RNA内含子剪切、poly（A）加尾、出核和完成蛋白翻译等生物学过程呢？大肠杆菌中的研究结果表明，NAD-RNA可以抵抗RNA焦磷酸水解酶（RNA-pyrophosphohydrolase，RppH）对其5′端的加工，进而避免被核糖核酸酶E（ribonuclease E，RNase E）降解［15］；此外，原核生物B.subtilis的NAD+加帽修饰也具有稳定RNA的作用，可防止RNase J1介导的5′端到3′端降解的发生［22］。不同于上述原核生物，真核生物中广泛存在一类具有脱帽功能的酶DXO蛋白，可以去除哺乳动物和拟南芥体内RNA的NAD+帽子，产生不稳定的5′单磷酸RNA（pRNA），并进一步催化将其降解，最终影响体内NAD-RNA的水平［23，27］，这表明原核和真核生物中RNA的NAD+加帽修饰可能具有不同的生物学意义。

高通量测序如RNA-seq、翻译组测序（ribosome profiling）等是研究RNA修饰的转录后调控等生物学过程的重要手段［7，32］。目前，部分研究小组已经开展了人源细胞HEK293T和拟南芥NAD+加帽修饰对mRNA加工和翻译影响的初步研究工作，结果显示NAD-RNA可顺利完成内含子剪切和poly（A）加尾过程［14，23，26，29］；同时，进一步检测到拟南芥的内源NAD-RNA富集于多聚核糖体，暗示了NADRNA可能具有蛋白编码的功能［14］。但是也有不同的研究结果被报道。在2017年，有研究人员将NAD+加帽和poly（A）加尾修饰的荧光素酶基因mRNA导入人源细胞HEK293T中，检测荧光素酶含量，发现与对照并无显著差异，推测外源NAD+-mRNA在HEK293T细胞不具备蛋白翻译的功能［23，33］。因此，关于体内NAD-RNA是否具有蛋白编码的能力、是否可以向胞质运输以及原核生物和真核生物NADRNA转录后调控的异同等仍有待深入研究。

3 RNA的NAD+加帽和脱帽分子机制初探

真核生物中基因转录成NAD -RNA的含量约占相应转录本总含量的1%-6%［14，23，24，33］，且体内NAD-RNA总含量也远低于m7G-RNA的占比［13］。NAD+加帽和脱帽反应的效率直接决定NAD-RNA的含量。不同于m7G-RNA的转录起始后加帽［34-37］，RNA的NAD+加帽反应可能存在两种模式，即转录起始和转录后加帽［33］。（1）转录起始加帽：在体外条件下或细菌体内，NAD+可作为一种稀有的起始核苷酸（non-canonical initiating nucleotide，NCIN）在细菌RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP）或真核生物RNAP II作用下，替代ATP作为首位碱基转录形成NAD-RNA［22，38-39］；相比细胞核RNAP，真核生物酵母和人的线粒体RNAP（mitochondrial RNAP，mtRNAP）可更加高效地利用NAD+合成NAD-RNA。此外，NAD+加帽的效率也受转录起始位点（transcription start site，TSS）序列（+1A）、TSS上游序列（-1R）以及细胞内的NAD+含量等因素影响［38，40］。利用CapZyme-Seq技术，研究人员分析了E. coli中约16 000个NAD-RNA基因启动子序列，发现决定NAD+加帽的启动子的特征序列为H-3R-2R-1A+1S+2W+3W+4，其 中A+1为TSS［41］。（2）转录后加帽：哺乳动物snoRNA（small nucleolar RNA）和 scaRNA（small cajal body RNA）是大多来源于基因内含子的非编码小RNA［42-44］，Jiao等［23］研究发现被核酸外切酶加工过的sno / scaRNA 5′端可被NAD+修饰，暗示哺乳动物体内可能存在转录起始后的加帽反应。

除了加帽效率，生物体内脱帽反应也是影响NAD-RNA含量的重要因素。DXO蛋白家族是一类可以清除真核生物体内异常帽子修饰RNA的酶［45］，如前所述，也具有清除NAD-RNA的功能。DXO的NAD+脱帽活性最早在哺乳动物细胞中被检测到，可去除体内部分NAD-RNA中的NAD+帽子并进一步催化降解pRNA［23］，模式植物拟南芥的DXO1蛋白也具有相似的功能［27］；进一步研究发现，当拟南芥DXO1功能缺失时，体内的NAD-RNA可被加工成小RNA［27］，暗示NAD-RNA在特定条件下可能通过小RNA介导的表观调控机制发挥作用，因此增加了NAD-RNA调控网络的复杂性。Nudix（nucleoside diphosphate linked to another moiety X）是另一类只具有脱帽活性的水解酶蛋白家族，E. coli的Nudix家族成员RppH可以催化三磷酸RNA（pppRNA）生成pRNA，进而由RNase E从5′端起始将其降解［10，46］；哺乳动物Nudix家族成员Dcp2、Nudt3和Nudt16可催化体内m7G-RNA的脱帽反应，而Nudt2、Nudt12、Nudt15、Nudt17和Nudt19则 具有体外去m7G帽子的活性［47］。最近的研究结果表明，Nudix也参与了NAD-RNA的脱帽过程，但不同于DXO蛋白，它在NAD+的烟酰胺和腺嘌呤之间发生酶解反应，并依赖于核糖核酸酶进一步降解脱帽的pRNA，例如，NudC和RppH可分别催化E. coli和B. subtilis体内NAD-RNA的脱帽反应，生成NMN（nicotinamide mononucleotide）和pRNA［15，22］；小鼠Nudt12靶向与DXO不同的NAD-RNA，主要参与编码线粒体蛋白的核基因mRNA的NAD+脱帽反应［25］；对哺乳动物22个Nudix成员的脱帽活性进行研究，发现除上述Nudt12外，Nudt16也具有去除RNA 5′端NAD+帽子的功能［48］。此外，真核生物糖基水解酶CD38可在体外反应条件下将NAD-RNA分解为成ADP-RNA和烟酰胺，暗示其可能是一类新的NADRNA脱帽酶［49］。然而，目前关于生物体内NADRNA加帽和脱帽等代谢过程以及调控途径的研究仍处于起步阶段，有待于在今后的研究中进一步挖掘解析。

4 NAD-RNA与生长发育和环境胁迫

生物体内NAD-RNA的丰度和种类与生长发育阶段和环境因素密切相关。研究发现，E. coli指数和稳定生长期NAD+加帽修饰的RNA有较大差异，除了两个时期共有的79个基因外，另有50个指数生长期特异表达的NAD-RNA基因以及150个稳定生长期特异表达的NAD-RNA基因［28］；拟南芥幼苗和花中NAD-RNA的丰度以及可转录生成NAD-RNA的基因亦存在一定的差异［14］，这些结果暗示基因的NAD+加帽修饰可能具有一定的时空表达特异性。与YEPD（yeast extract peptone dextrose）培养基相比，生长在合成培养基上的酵母体内NAD+-mRNA基因种类更多［24］；将人源HEK293T和包皮成纤维细胞进行热激（42℃）处理或置于葡萄糖缺失的培养基中培养，NAD-RNA的含量均显著提高［25］；拟南芥幼苗NAD-RNA可响应脱落酸（abscisic acid，ABA）处理，并且多数响应ABA的NAD-RNA的脱帽过程不依赖DXO1［27］；对可转录成NAD-RNA的基因进行GO分析，它们部分富集于非生物胁迫相关的路径［14，15，24，26-29］，以上结果表明NAD-RNA的合成与代谢过程与外界环境因素也密切相关，这可能与NAD+的辅酶特性有关。

5 总结与展望

借助于LC-MS和NAD captureSeq等技术，人们发现了RNA 5′端的NAD+加帽这一新的修饰类型。NAD+作为一种辅酶，在转录过程中可替代ATP作为起始碱基、通过RNAP/RNAP II的催化生成NADRNA，并进一步完成内含子剪切、poly（A）加尾等转录后加工过程。不同于经典的真核生物m7G帽子，NAD+加帽修饰在原核和真核生物RNA上均可检测到，并且该修饰对RNA在原核和真核生物中稳定性的影响存在差异；同时，真核生物中NAD-RNA的占比远低于m7G-RNA。基于此，我们推测NADRNA的起源进化可能要早于m7G-RNA，早期在原核生物中NAD+加帽具有保护RNA不被降解、维持其稳定性的作用；但随着生物的进化，NAD-RNA可能发生了功能分化，被真核生物识别为异常RNA，进而被DXO等脱帽酶脱帽并进一步降解，与此同时真核生物RNA被特有的m7G帽子所保护而不被降解并完成后续一系列的转录、转录后和翻译等过程，逐渐替代NAD-RNA占主导地位。

后续可从以下几个方面进行研究，来验证上述猜测：（1）开展关于NAD-RNA和m7G-RNA代谢通路重要基因的进化分析；（2）鉴定与NAD+加帽、脱帽、识别等过程相关的基因，并通过这些基因的功能研究解析NAD-RNA的变化对生物体的影响；（3）NAD-mRNA能否完成正常的蛋白翻译过程，与m7G-RNA一样以蛋白形式发挥功能？或者直接以RNA形式作为调控因子发挥功能？（4）NAD+修饰的非编码RNA是否具有调控功能？

除了NAD-RNA，近年来在生物体内还检测到了许多其他类型加帽修饰的RNA，比如dpCoA-RNA、FAD-RNA、UDP-Glc-RNA和UDP-GlcNAc-RNA等，它们在体内的含量也远低于m7G-RNA［13］。然而，这些RNA序列信息以及与NAD-RNA、m7G-RNA是否存在着关联仍然未知。相信随着后续相关分析技术的突破，将会促进该领域相关研究工作的开展，进一步拓展和丰富RNA生物学基础理论知识。