鱼籽多肽对小鼠记忆改善的影响

陈静，魏鉴腾，陈文雅，刘晔玮

（兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生学研究所，甘肃 兰州 730000）

记忆是人脑对过去经验的保持和再现，它是进行思维、想象等高级心理活动的基础[1]。应激、衰老、代谢综合征及危险基因等都是引起记忆障碍的危险因素[2]。随着社会的高速发展，生活节奏加快，学习、工作压力增加，而由压力引起的焦虑、抑郁、失眠等状态会对大脑造成一定的损伤，最直接的结果便是头痛、记忆力下降等症状[3]。记忆障碍的持续发展会导致认知障碍，严重者还会导致中枢神经系统疾病，如帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、亨廷顿病（Huntington disease，HD）、肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等[4]。因此，研究和开发改善记忆障碍的功能食品已成为研究的热点。

生物活性肽由结构多样的氨基酸组成，通过蛋白质水解获得[5]，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力、保护心血管等多种生物学作用[6]。此外，许多研究表明一些生物活性肽具有改善记忆的功能，如裴新荣等[7]以鲑鱼鱼皮等深海鱼皮为主要原料制备的海洋胶原肽，林海生[8]以牡蛎为原料制备的牡蛎蛋白肽及Wu等[9]研究了五肽Gln-Met-Asp-Asp-Gln与Ala-Gly-Leu-Pro-Met对小鼠记忆改善的协同作用。鱼籽多肽是以鱼籽为原料经蛋白酶水解后得到的多肽，氨基酸种类及含量丰富、营养价值较高、具有多种生物活性。但目前关于鱼籽多肽改善记忆的研究鲜有报道。本文通过研究鱼籽多肽对小鼠记忆改善的作用，为鱼籽多肽的高值化开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鲅鱼鱼籽：市售。

1.1.2 试验动物

SPF级雌性KM种小鼠（144只，体重为18g～22g）：北京华阜康生物科技股份有限公司。动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。动物房内温度20℃～22℃，相对湿度40%～70%，12 h光照，12 h黑暗，均标准饲料喂养。动物质量合格证：No.110322200101173261。

1.1.3 主要仪器及试剂

YLS-3TB型跳台仪、YLS-17B型穿梭箱、XRXR101型Morris水迷宫仪：淮北正华生物仪器设备有限公司；SMART 3.0小动物行为学视频采集与分析系统：深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

无水乙醇（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 鱼籽多肽的制备

鱼籽多肽的制备参考文献[10]稍作修改。鱼籽和水经高速剪切、酶切、灭酶、离心、烘干等，获得鱼籽多肽。

1.2.2 动物分组及干预

144只KM种雌性小鼠分为3组，分别用于跳台实验、穿梭箱实验和Morris水迷宫实验。48只小鼠随机分为空白对照组和鱼籽多肽低、中、高剂量组4个组，灌胃剂量分别为 0、0.17、0.33、1.00 g/kg BW，经口灌胃量为10 mL/kg BW，空白对照组给予等量无菌水，1次/d，持续 41 d。

1.2.3 跳台实验

跳台实验参照文献[11]的方法略作修改。末次给受试物后次日开始训练，将小鼠放置在绝缘平台上，记录每只小鼠第1次跳下平台的潜伏期和5 min内跳下平台的错误次数。24 h后重新测试，记录每只小鼠3 min内第1次跳下平台的潜伏期及跳下平台的错误次数和受到电击的小鼠总数。5 d后进行消退实验。

1.2.4 穿梭箱实验

穿梭箱实验参照文献[12]的方法略作修改。末次给受试物后次日开始训练。小鼠在箱内适应60 s后，持续灯光15 s，给予10 s电刺激（电流0.2 mA）。间隔1 d训练一回，每回30次，连续训练3回记录并分析小鼠主动、被动回避次数，小鼠主动、被动回避时间，计算小鼠主动回避率。24 h后重新测试。5 d后进行消退实验。

1.2.5 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验参照文献[13]的方法略作修改。末次给受试物后次日开始训练。实验全程严格保持室内物体位置固定以及光照强度恒定（25 W）后开始测试。将小鼠从同一象限放入水中开始实验，若小鼠进入平台停留时间超过3 s或总时长60 s后停止计时，记录数据。若小鼠60 s内未进入平台，手动将其放入平台停留30 s。24 h后重新测试。5 d后进行消退实验。

1.2.6 数据分析

采用SPSS21.0软件进行统计学分析。计量资料用平均值±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），两两比较采用LSD检验或Dunnett T3检验，以p＜0.05表示差异有统计学意义。跳台实验跳下平台的错误次数及受电击动物数、穿梭箱实验主动和被动回避次数、Morris水迷宫实验穿台次数采用χ2检验。

2 结果与分析

2.1 鱼籽多肽对小鼠体重的影响

鱼籽多肽对小鼠体重的影响见表1。

表1 鱼籽多肽对小鼠体重的影响Table 1 The effect of polypeptides from fish roes on the weight of mice

由表1可见，经连续灌胃给予小鼠不同剂量的鱼籽多肽41 d后，跳台实验、穿梭箱实验及Morris水迷宫实验低、中、高剂量组小鼠的体重与对照组相比，无显著差异（p＞0.05）。结果表明鱼籽多肽对小鼠的体重无不良影响。

2.2 鱼籽多肽对小鼠跳台实验的影响

鱼籽多肽对小鼠跳台实验的影响见表2～表4。

由表2可见，高剂量组小鼠测验时跳下平台的潜伏期与对照组相比，差异有统计学意义（p＜0.05）；低、中剂量组虽未有统计学意义，但是从结果中可以看出潜伏期有延长的趋势。由表3可见，高剂量组小鼠测验时跳台错误次数与对照组相比，差异有统计学意义（p＜0.05）；低、中剂量组虽未有统计学意义，但是从结果中可以看出跳台错误次数有减少的趋势。由表4可见，高剂量组小鼠测验时受电击动物数与对照组相比，差异有统计学意义（p＜0.05）；低、中剂量组虽未有统计学意义，但是从结果中可以看出受电击动物数有减少的趋势。

表2 鱼籽多肽对小鼠跳台潜伏期的影响Table 2 The effect of polypeptides from fish roes on diving latency in mice jumping platform

表3 鱼籽多肽对小鼠跳台错误次数的影响Table 3 The effect of polypeptides from fish roes on the number of errors in mice jumping platform

表4 鱼籽多肽对小鼠跳台受电击动物数的影响Table 4 The effect of polypeptides from fish roes on the number of animals subjected to electric shock in mice jumping platform

2.3 鱼籽多肽对小鼠穿梭箱实验的影响

鱼籽多肽对小鼠穿梭箱实验的影响见表5～表7。

由表5可见，中剂量组小鼠测试时主动回避时间与对照组相比，差异有统计学意义（p＜0.05）；低、高剂量组虽未有统计学意义，但是从结果中可以看出主动回避时间有缩短的趋势。由表6可见，各剂量组小鼠测验时被动回避时间与对照组相比，差异无统计学意义（p＞0.05），但是从结果中可以看出小鼠被动回避时间有缩短的趋势。由表7可见，各剂量组小鼠测验时主动回避只数与对照组相比，差异无统计学意义（p＞0.05），但是从消退期的结果中可以看出主动回避的小鼠数有增多的趋势。

表5 鱼籽多肽对小鼠穿梭箱主动回避时间的影响Table 5 The effect of polypeptides from fish roes on active evading time of shuttle box of mice

表6 鱼籽多肽对小鼠穿梭箱被动回避时间的影响Table 6 The effect of polypeptides from fish roes on passive evading time of shuttle box of mice

表7 鱼籽多肽对小鼠穿梭箱主动回避数的影响Table 7 The effect of polypeptides from fish roes on actively evadingin the shuttle box of mice

2.4 鱼籽多肽对小鼠Morris水迷宫实验的影响

鱼籽多肽对小鼠Morris水迷宫实验的影响见表8～表 9。

表8 鱼籽多肽对小鼠Morris水迷宫实验潜伏期的影响Table 8 The effect of polypeptides from fish roes on the latent period of Morris water maze test in mice

表9 鱼籽多肽对小鼠Morris水迷宫实验穿台次数的影响Table 9 The effect of polypeptides from fish roes on the number of crossing the platform in the Morris water maze test in mice

由表8可见，各剂量组小鼠测验潜伏期与对照组相比，差异无统计学意义（p＞0.05）。但是从结果中可以看出潜伏期有缩短的趋势。由表9可见，中剂量组小鼠测试时的穿台次数与对照组相比，差异有统计学意义（p＜0.05）；低、高剂量组虽未有统计学意义，但是从结果中可以看出穿台次数有增多的趋势。

3 结论与讨论

跳台实验、穿梭箱实验以及Morris水迷宫实验是常用来研究改善记忆的动物实验[14]。跳台实验中，当把小鼠放在平台上时，它会立即跳下平台，如果小鼠跳下平台时受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害刺激。多数小鼠可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台。因此，小鼠跳台潜伏期越长、跳下平台的错误次数越少和受电击动物数越少证明小鼠的记忆能力越好。穿梭箱实验是将小鼠放入箱子中，待小鼠适应环境后，利用暗箱中的铁栅与小鼠的双脚形成闭合回路，给予小鼠电击，若小鼠在受到声音刺激时主动逃到箱体的一端，则不会被电击，否则将会遭到电击。因此小鼠的主被动回避时间越短证明小鼠的记忆能力越好。Morris水迷宫实验主要用于检测实验动物的运动和空间位置记忆能力，同时能较准确地反映与海马体功能直接相关的动物的空间学习记忆能力[15]。在实验中，将小鼠在固定位置面向池壁轻放入水中并开始计时，若小鼠在60 s内找到站台并停留10 s，则以停留10 s后的时间作为潜伏期。若小鼠在60 s内未找到站台则将其引至站台并停留10 s，潜伏期记为60 s。小鼠连续训练5 d后，观察记录其上站台的潜伏期。在定位航行实验完成后，待小鼠休息一段时间，撤去站台，在固定位置将小鼠面向池壁放入水中，记录其60 s内其穿越站台区的次数。因此，当小鼠的穿台次数越多、潜伏期越短证明小鼠的记忆力越好。

本实验的鱼籽多肽以鱼籽为原料，经高速剪切及酶解得到[10]。研究表明，鱼籽多肽中有较为丰富的谷氨酸、天冬氨酸和L-亮氨酸[16]。谷氨酸是中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质，通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体，进而产生长时程增强效应（long-term potentiation，LTP），实现学习记忆过程[17]。L-亮氨酸通过激活mTOR及其下游底物（4E-BP1和P70S6K）对记忆损伤有一定的改善作用[18]。推测谷氨酸和L-亮氨酸为使鱼籽多肽具有记忆改善作用的主要氨基酸成分。鱼籽多肽是经酶解得到的多肽混合物，其物质基础及作用机制还有待进一步研究。

研究结果表明，跳台实验高剂量组小鼠测验时跳下平台的潜伏期延长、跳下平台错误次数、跳下平台动物数与对照组相比明显减少（p＜0.05）。穿梭箱实验中剂量组小鼠测验时主动回避时间与对照组相比明显缩短（p＜0.05）。Morris水迷宫实验中剂量组小鼠测试时的穿台次数与对照组相比明显增加（p＜0.05）。综上所述，鱼籽多肽对小鼠的记忆功能有一定的改善作用，本实验结果可为鱼籽多肽改善记忆功能食品的应用开发提供实验基础和理论指导。