乳香与醋乳香对2型糖尿病大鼠改善作用的对比研究❋

宋志前， 刘振丽， 彭诗涛， 万晓莹， 王 淳， 宁张弛

(中国中医科学院中医基础理论研究所， 北京 100700)

近年来，我国糖尿病人数快速增长。据世界卫生组织预测，到2050年我国糖尿病患者数量将居世界首位[1]。糖尿病的致死率和致残率高[2]，对人类健康造成了重大威胁，开展糖尿病的防治工作至关重要。

乳香为橄榄科植物乳香树BoswelliacarteriiBirdw.及同属植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw.树皮渗出的树脂具有活血定痛、消肿生肌的功效，是治疗血瘀证的要药之一[3]。中医认为，糖尿病属于消渴范畴。据《灵枢·五变》记载：“血脉不行，转而为热，热则消肌肤，故为消瘅。”血瘀贯穿于糖尿病发展的整个过程，而乳香是治疗血瘀证的重要中药之一[4-6]。炮制是中医临床用药的特色，中药必须经过炮制才能供临床使用[7]。传统中药炮制理论认为，乳香经过醋炙后，可增强其活血行气止痛功效，降低刺激性[8]。而醋乳香对2型糖尿病模型动物是否有作用，以及醋炙前后作用是否存在差异还未见研究报道。本研究采用链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)作为诱导剂，辅以高脂饲料喂养，构建2型糖尿病大鼠模型，在给药的过程中监测体质量和空腹血糖的变化，通过比较乳香、醋乳香给药大鼠血液中的胰岛素、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin, GHb)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、内皮素-1(endothelin-1, ET-1)水平和胰岛病理切片，探究乳香醋炙前后对糖尿病大鼠的作用差异。本研究经中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物伦理审查委员会批准，伦理编号2018-066。

1 材料

1.1 动物

采用30只雄性清洁级SD大鼠，体质量(280±10)g，购自中国食品药品检定研究所，实验动物许可证号SYXK(京)2017-0005。饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所SPF级动物房，环境温度(25±2)℃，相对湿度50%～70%，常规适应性饲养1周后开始实验。

1.2 饮片、药品及试剂

乳香(批号805270216)，购自北京同仁堂药店，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为橄榄科植物乳香树BoswelliacarteriiBirdw.树皮渗出的树脂；盐酸二甲双胍片(0.5 g/片，中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370)；STZ(Sigma-Aldrich，货号101252400)；羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na，上海沪试，货号20161025)；甲醛(天津福晨，货号20180420)；一次性使用采血针(苏州施莱，货号C0944)；ACCU-CHEK血糖试纸(上海罗氏，货号06656757)；大鼠胰岛素ELISA试剂盒(上海沪峰，货号20011649R)；糖化血红蛋白试剂盒(上海沪峰，货号20011650R)。

1.3 仪器

低温离心机(型号5418R)Eppendorf；数字式超级恒温浴槽(型号HSS-1B)上海安亭公司；酶标仪(型号Multiskan MK3)Thermo Fisher；倒置显微镜(型号CKX41)Olympus；石蜡包埋机(型号OML-BMA)湖北欧美莱公司，手动旋转式石蜡切片机(型号SLEE)Labsun。

2 方法

2.1 乳香及醋乳香混悬液的配制

根据前期研究筛选的实验条件及2020版《中华人民共和国药典》[3]制备醋乳香。称取适量乳香采用中火加热，电磁炉温度达到130 ℃后投入乳香不断翻炒，炒制约9 min后观察到乳香表面微溶、冒烟，按照乳香与米醋10∶1的比例喷入米醋继续翻炒，约11 min后观察到表面呈油亮光泽时迅速取出，将炒制好的醋乳香转移至托盘中摊放晾凉，备用。

取等量的乳香和醋乳香，相同条件下粉碎过100目筛。按照70 kg人体用药剂量，用0.5%CMC-Na溶液制成浓度为86.4 g/L的乳香和醋乳香混悬液，4 ℃储存备用。用时室温放置60 min，振摇使其混匀。

2.2 二甲双胍混悬液的配制

称取适量二甲双胍片粉碎，过100目筛。按照70 kg人体用药剂量，用0.5%CMC-Na溶液配成浓度为13.5 g/L的二甲双胍混悬液，4 ℃储存备用，用时室温放置60 min，振摇使其混匀。

2.3 STZ溶液配制

避光条件下称取0.5 g STZ，加入50 mL 0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液，充分震荡使其溶解，现用现配。

2.4 诱导大鼠糖尿病模型

大鼠自适应性饲养1周。禁食12 h后，按照50 mg/kg剂量一次性腹腔注射STZ柠檬酸钠缓冲液，并采用高脂饲料喂养，7 d后取尾尖静脉血检测空腹血糖，空腹血糖值大于16.0 mmol/L则为造模成功。

2.5 分组与给药

除正常组外，将模型动物分为模型组、乳香组(0.90 g/kg)、醋乳香组(0.90 g/kg)、阳性药组(0.135 g/kg)4组各6只。正常组与模型组给予0.5% CMC-Na溶液，阳性药组给予盐酸二甲双胍混悬液，乳香组和醋乳香组分别给予临床等效剂量的相应药物，每天灌胃给药1次，连续给药2周。

2.6 取材

末次给药后禁食8 h，测定各组大鼠空腹血糖。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剂量为0.3 mL/100 g。麻醉后固定于手术台，打开腹腔暴露腹主动脉，以10 mL注射器收集全血分装至血清管及EDTA抗凝管中。同时取大鼠胰腺，用0.9%氯化钠溶液冲洗干净后，浸入10%中性甲醛缓冲液中固定。

2.7 指标检测

2.7.1 体质量及空腹血糖检测 采集大鼠的体质量数据，每周1次，同时取尾尖静脉血检测空腹血糖值并记录。

2.7.2 ELISA法检测血中胰岛素、GHb、NO及ET-1含量 参照ELISA试剂盒说明书方法，分别测定各组大鼠血清中的胰岛素、NO、ET-1和EDTA抗凝全血中的GHb水平。

2.7.3 苏木精-伊红(hematoxylin-eosi，HE)染色法观察胰腺病理切片 10%中性甲醛缓冲液固定24 h后进行常规脱水、透明处理，胰腺组织采用常规石蜡包埋、切片，切片厚度约为5 μm，取石蜡切片，采用HE染色法，在光学显微镜下评估胰腺组织病理变化。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠体质量和空腹血糖结果

图1a示，体质量结果显示，在造模1周内STZ诱导的模型组大鼠体质量较正常组显著下降(P<0.01)，在随后2周的药物干预作用下，二甲双胍阳性药组体质量显著增加(P<0.01)，乳香和醋乳香组大鼠的体质量较模型组亦显著增加(P<0.01)，且醋乳香对糖尿病大鼠的体质量增加作用大于乳香(P<0.01)。

注：a.体质量；b. 空腹血糖；与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05,##P<0.01；与乳香组比较：&&P<0.01图1 乳香醋炙前后对糖尿病模型大鼠体质量及空腹血糖干预作用比较(n=6)

注：a. 胰岛素；b. 糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin, GHb)；c. 一氧化氮(Nitric oxide, NO)；d. 内皮素-1(Endothelin-1, ET-1)；与正常组比较:**P<0.01；与模型组比较:#P<0.05,##P<0.01；与乳香组比较:&&P<0.01图2 乳香醋炙前后对糖尿病模型大鼠血中胰岛素、GHb、NO及ET-1的干预作用(n=6)

图1b示，在造模后1周内，各组STZ造模大鼠空腹血糖值相比于正常组显著升高(P<0.01)，并逐渐趋于稳定。在随后2周的药物干预中，乳香、醋乳香及二甲双胍均能显著降低大鼠空腹血糖值(P<0.05或P<0.01)，醋乳香改善血糖的作用优于乳香(P<0.01)，且在第3周的改善作用最佳。

3.2 各组大鼠血中胰岛素、GHb、NO及ET-1结果

图2a示，与正常组比较，模型组大鼠的胰岛素水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较，乳香组、醋乳香组和二甲双胍组胰岛素水平均显著提高(P<0.01)，且醋乳香组的升高作用优于乳香组(P<0.01)。

图2b、图2c、图2d示，与正常组比较，模型组大鼠GHb、NO、ET-1水平均显著提升(P<0.01)；与模型组比较，乳香组、醋乳香组和二甲双胍组血中GHb、NO、ET-1水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)，且醋乳香组的降低作用均优于乳香组(P<0.01)。

3.3 各组大鼠胰腺组织病理学观察结果

图3示，正常组大鼠胰岛分布于腺泡之间呈球形，边缘整齐，胰泡细胞无变性、坏死等病变。而模型组大鼠细胞数量减少，形态不规则，胰岛萎缩。二甲双胍组大鼠胰腺结构显著改善，乳香组和醋乳香组较模型组大鼠均有所改善，且醋乳香的干预效果优于乳香。

注：a.正常组； b.模型组；c.乳香组； d.醋乳香组；e.二甲双胍组图3 乳香醋炙前后对糖尿病模型大鼠胰腺组织的干预作用(HE×200)

4 讨论

目前国外临床研究显示，乳香可以有效治疗糖尿病，糖尿病患者以250 mg日服用剂量连续服用8周后，其空腹血糖、GHb和甘油三酯均显著降低[9]。另有报道，以900 mg/d剂量的乳香干预2型糖尿病患者6周后，患者血清中的高密度脂蛋白、胆固醇和果糖胺水平均显著下降；谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平均极显著降低[10，11]。Azadmehr等[12]通过临床研究证实，乳香可以显著降低空腹血糖、胰岛素抵抗指数、GHb、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，具有抗氧化、降糖、降脂的功效。现代药理学研究表明，乳香在降低糖尿病模型大鼠血糖的同时，还能降低炎性因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等的分泌[13]。

中医理论认为，元气虚衰、气血津液留滞导致的血瘀是2型糖尿病的病因病机之一[14，15]。现代临床和实验研究证实，在糖尿病发生发展过程中，瘀血作为致病因素贯穿始终。祝谌予最先提出糖尿病“瘀血为患”的观点[16]，并发现临床大多数糖尿病患者具有舌质紫暗、舌上有瘀点或瘀斑、舌下青紫或见面部瘀斑等血瘀证表现，行活血化瘀法治疗后病情有较大改善，故将血瘀列为糖尿病的重要病机[17]。而林兰认为血瘀是糖尿病的重要病理产物，也是重要的致病因素，影响糖尿病的转归和预后[18]。在糖尿病病理状态下，气、血、津液运化失调产生的痰、瘀、浊、毒在血脉形成蓄积[19]，脏腑之中玄府运化失调产生“糖毒”与诸邪滋生“浊毒”，日久损伤络脉，气虚无力推动血脉中的浊毒，又可导致“流滞”的发生[14]。乳香气香能香窜调气，味辛能散瘀活血，性温能通经络，内能宣通脏腑气血，外能透达经络，可用于一切气滞血瘀诸证，包括2型糖尿病的防治。

乳香醋炙一直是中医药临床的用药特色，研究显示炮制可以增强中药疗效。本研究结果表明，乳香醋炙后可以显著提升2型糖尿病大鼠的胰岛素水平，降低空腹血糖及GHb含量，抑制NO及ET-1水平，可见醋炙确实提升了乳香对2型糖尿病的改善作用。

醋炙对乳香化学成分的影响是改变其药效作用的基础，乳香最主要的活性成分是三萜类的乳香酸成分[19-21]，主要包括11-羰基-β-乳香酸(11-keto-β-boswellic acid，KBA)和3-乙酰-11-羰基-β-乳香酸(3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid，AKBA)、β-乳香酸(β-boswellic acid，β-BA)等[22-24]。课题组前期研究结果表明，乳香醋炙前后乳香酸类成分变化明显，其中AKBA与β-BA的含量大大提升[25，26]，同时还发现具有9,11-去氢结构的乳香酸成分在醋炙后含量增加了10.8倍之多。此外，乳香醋炙过程的炮制辅料醋也同样对乳香活血作用的改善发挥了积极作用。课题组前期研究发现，醋中含有丰富的具有活血止痛作用的川芎嗪、四氢哈尔满碱、麦角胺等活性成分，因此辅料醋中的成分也是乳香醋炙后活血止痛作用增强的重要物质基础[19]。尽管针对乳香及其主要乳香酸成分干预2型糖尿病的机制研究有限，但有报道显示乳香酸类成分的抗炎机制与糖尿病等慢性炎症疾病的发生发展密切相关，其可通过系统调控TNF-α诱导基因变化而发挥作用，如基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)、基质金属蛋白酶-10(matrix metalloproteinase-10，MMP-10)和基质金属蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12，MMP-12)[27]。另有研究表明，乳香还可介导磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路，抑制血管舒张因子NO和一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的分泌[13]。本研究的实验结果表明，乳香醋炙后降低NO及ET-1作用更加显著，可见醋乳香能够通过调节血管的炎症环节改善2型糖尿病，但何种成分对2型糖尿病产生确切疗效以及其介导血管炎症的生物学机制还需进一步研究加以论证。