宫内发育迟缓仔猪小肠形态和屏障功能相关基因的表达特征

2022-03-10张旺宏孔祥峰

动物营养学报 2022年2期

唐武张旺宏孔祥峰

(1.中国科学院亚热带农业生态研究所，动物营养生理与代谢过程湖南省重点实验室，长沙410125；2.中国科学院大学，北京100049)

新生仔猪宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)的发生率为6%～10%，早期死亡率高达75%，这给养猪业造成了较大的经济损失[1-2]。肠道屏障可通过机械、化学、免疫和生物屏障的互作，调节机体稳态，抵抗病原体和食源性抗原的入侵，对维持动物肠道健康至关重要[3]。因此，评价IUGR仔猪的小肠形态和屏障功能特征，可以为调控其肠道发育与健康提供依据。研究发现，IUGR新生仔猪的肠道发育和屏障功能受损严重[4]。与正常出生体重(normal birth weight，NBW)仔猪相比，IUGR仔猪的小肠绒毛变短且数量较少、隐窝细胞凋亡增加、刷状缘酶活性降低[5]；IUGR仔猪的紧密连接发育不完善，导致肠道屏障的通透性增加[6]；IUGR新生仔猪的小肠上皮杯状细胞和淋巴细胞数量减少[7]，白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎细胞因子的含量升高[8]。此外，IUGR仔猪肠黏膜上附着的总细菌数量增加[9]。笔者前期研究也发现，不同生长阶段的IUGR猪，其肠道微生物多样性显著降低，且更易富集一些病原菌和条件致病菌，其肠道微生物屏障受损[10-11]。小肠绒毛、紧密连接蛋白和黏膜免疫细胞分别在肠道营养物质吸收、通透性维持和炎症反应方面发挥着重要作用，是评价小肠健康的重要指标[12]。因此，本文比较了1～28日龄IUGR仔猪和NBW仔猪小肠形态、紧密连接蛋白和免疫细胞因子表达的差异，为IUGR仔猪肠道发育的调控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

动物试验在中国科学院亚热带农业生态研究所永安试验基地开展。试验选取“长白×大白”杂交新生仔猪24窝(第3～4胎次母猪生产，产仔数12头左右)。称取仔猪初生体重，统计产仔数，并计算窝重。根据Bauer等[13]的方法，从每窝初生重低于平均体重10%的仔猪中选取1头IUGR仔猪(IUGR组，平均体重为0.98 kg)、从大于平均体重10%的仔猪中选取1头NBW仔猪(NBW组，平均体重为1.68 kg)。所选仔猪均随母猪自然哺乳，不调栏。5～21日龄补充商品教槽饲粮，21日龄断奶后饲喂商品教槽饲粮至28日龄。饲喂、饮水、光照和免疫等饲养管理按养殖场规范操作。

1.2 样品采集

分别于7、21和28日龄时选取IUGR仔猪和NBW仔猪各8头(每窝选取1头IUGR仔猪和1头NBW仔猪)，空腹称重，7、21和28日龄选取的IUGR仔猪和NBW仔猪平均体重分别为1.77和2.79 kg、4.71和6.45 kg、5.06和7.96 kg[10]。麻醉放血处死，取中段部位的空肠和回肠组织，用10%中性福尔马林溶液固定，用于肠道形态学观察。刮取中段部位的空肠和回肠黏膜，液氮速冻后-80 ℃保存，用于mRNA表达分析。

1.3 小肠形态观察

取固定的小肠组织，经修整、洗涤、脱水、透明、浸蜡和包埋等步骤后，再切片、苏木精-伊红(HE)染色和封片，并在显微镜下观察空肠和回肠组织形态，测定绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)值。

1.4 小肠黏膜屏障相关基因表达分析

取-80 ℃冻存的空肠和回肠黏膜样品，液氮中研磨，并根据RNA TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，采用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定其浓度，用PrimeScript RT试剂盒将其反转为cDNA。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因、cDNA为模板，利用ABI-7900HT RT PCR仪(Applied Biosystems，美国)测定小肠黏膜中紧密连接蛋白闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、封闭蛋白-1(claudin-1)和闭合蛋白(occludin)，抗炎细胞因子白细胞介素-4(IL-4)，以及促炎细胞因子IL-8、白细胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α等基因的mRNA相对表达量。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1，根据2-ΔΔCt法对数据进行处理分析。

表1 引物序列

1.5 数据统计与分析

试验数据用Excel 2019初步整理后，采用SPSS 22.0软件进行统计分析，试验结果以“平均值±标准误”表示，小肠形态测量和黏膜基因mRNA相对表达量比较使用独立样本t检验，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 IUGR和NBW仔猪小肠形态的差异

由表2可知，与NBW仔猪相比，IUGR仔猪7日龄时空肠绒毛高度、21日龄时空肠和回肠绒毛高度显著降低(P<0.05)，28日龄时空肠隐窝深度显著提高(P<0.05)，其他指标差异不显著(P>0.05)。由图1和图2可知，IUGR仔猪空肠和回肠黏膜出现不同程度的损伤。

2.2 IUGR和NBW仔猪小肠黏膜屏障功能相关基因mRNA表达的差异

由表3可知，与NBW仔猪相比，IUGR仔猪7日龄时空肠黏膜ZO-1、claudin-1、occludin、IL-4和IL-8以及21日龄时空肠黏膜ZO-1和occludin、回肠黏膜ZO-1的mRNA相对表达量显著下调(P<0.05)；28日龄时空肠黏膜TNF-α、回肠黏膜IL-1β的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05)，回肠黏膜IL-4的mRNA相对表达量显著下调(P<0.05)。

表2 IUGR和NBW仔猪小肠形态的差异

3 讨论

肠道形态和功能的完整性对营养物质的吸收至关重要。小肠绒毛高度和隐窝深度是评定小肠形态的重要指标。绒毛高度越高则小肠吸收表面积就越大，其吸收功能就越强；隐窝深度越小则小肠上皮细胞就越成熟，其分泌功能就越强[14]。本研究中，与NBW仔猪相比，IUGR仔猪7日龄时空肠绒毛高度、21日龄时空肠和回肠绒毛高度显著降低，28日龄时空肠隐窝深度显著提高，提示IUGR仔猪小肠的吸收和分泌功能减弱。同样，Su等[15]研究发现，IUGR断奶仔猪小肠绒毛高度和绒毛表面积显著降低，隐窝深度显著提高；Li等[16]报道，IUGR断奶仔猪小肠绒毛高度显著降低。这可能与IUGR胎儿优先保障脑等重要器官的发育，肠道等相对次要器官的血流量供给减少，从而导致肠道隐窝-绒毛轴发育异常[17]。

肠黏膜的紧密连接是机体防御病原菌入侵的重要屏障[18]。当紧密连接功能受损时，有害物质进入血液循环引发机体炎症甚至疾病[19]。ZO-1、封闭蛋白(claudin)和occludin等紧密连接蛋白是决定肠黏膜通透性的重要分子[20]。本研究中，与NBW仔猪相比，IUGR仔猪7日龄时空肠黏膜ZO-1、claudin-1和occludin以及21日龄时空肠黏膜ZO-1和occludin、回肠黏膜ZO-1的mRNA相对表达量显著下调，提示IUGR哺乳仔猪的肠黏膜完整性受损。研究发现，大肠杆菌感染时仔猪肠黏膜ZO-1的表达量显著降低[21]；7～28日龄IUGR仔猪肠道菌群的多样性降低，病原菌和条件致病菌丰度升高[10]。这可能与肠黏膜的紧密连接结构受损、肠黏膜通透性提高有关。

图1 IUGR和NBW仔猪空肠形态的差异

图2 IUGR和NBW仔猪回肠形态的差异

细胞因子在维持机体免疫反应和肠道屏障功能方面发挥着重要作用[22]。炎性细胞因子与紧密连接蛋白的改变密切相关[23]。本研究中，与NBW仔猪相比，IUGR仔猪7日龄时空肠黏膜IL-4、28日龄时回肠黏膜IL-4的mRNA相对表达量显著下调，28日龄时空肠黏膜TNF-α、回肠黏膜IL-1β的mRNA相对表达量显著上调，提示IUGR仔猪肠道中存在炎症反应。Wang等[24]也报道，与同窝NBW仔猪相比，IUGR新生仔猪血液炎症细胞因子和免疫球蛋白G含量显著降低，7和14日龄IUGR仔猪的空肠上皮内白细胞数量显著增加。这可能与肠道屏障受损有关；此外，本研究中，与NBW仔猪相比，IUGR仔猪7日龄时空肠黏膜IL-8的mRNA相对表达量显著下调，其原因仍有待进一步研究。