发酵金针菇多糖通过核转录因子-κB-NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3信号通路抑制巨噬细胞炎症反应

2022-03-10高青莹徐建雄

动物营养学报 2022年2期

马升高青莹徐建雄

(上海交通大学农业与生物学院，上海市兽医生物技术重点实验室，上海200240)

炎症反应是机体受到损伤或有害刺激后产生的一种适应性反应[1]，其与许多疾病如肝硬化、癌症和糖尿病等慢性疾病的发展联系密切[2]。巨噬细胞是一种位于组织内的白血球，可以对细胞残片及病原体进行吞噬和消化，当受到脂多糖(LPS)等刺激后会出现炎症反应，表现为一氧化氮(NO)分泌增加，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达升高[3]。核转录因子-κB(NF-κB)是参与细胞对外界刺激响应的蛋白，在调控机体炎症中发挥了重要作用，同时也是NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)信号通路激活的启动信号[4]。NF-κB p65通常与核转录因子-κB抑制蛋白α(IκBα)以非活性形式结合在细胞质上。当细胞被细菌或病毒刺激时，IκBα和NF-κB p65被降解，从而进入细胞核执行其功能[5]。研究发现，NLRP3信号通路可识别外来微生物感染和细胞内危险信号[6]，通过NLRP3炎性小体的聚集介导宿主对微生物感染和细胞损伤的免疫反应，导致半胱天冬蛋白酶-1(Caspase-1)蛋白转化为活化的Caspase-1以及细胞因子前体白细胞介素-1β(Pro-IL-1β)和前体白细胞介素-18(Pro-IL-18)转化为成熟的白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)[7]。

金针菇(Flammulinavelutipes)学名毛柄金钱菇，因其营养丰富和口感鲜美而备受消费者喜爱[8]。金针菇富含多糖、甾醇、蛋白质和膳食纤维等多种活性物质[9]。金针菇多糖(FVP)是从金针菇中提取的水溶性多糖[10]，具有多种生物活性，体现在抗氧化[11]、促进肠道健康[12]、免疫调节[13]等方面。FVP能增强巨噬细胞的吞噬活性，调控巨噬细胞分泌炎性介质、干扰素和细胞因子等，进而增强机体的抗炎能力[14]。Zhao等[15]发现FVP可以减轻溃疡性结肠炎症状，降低炎症基因的表达水平，并增强机体的代谢和免疫能力。

发酵具有周期短、成本低、产量大、有工业化生产前景等优势，金针菇在发酵过程中除产生菌丝体外，还会在发酵液中产生多糖、多肽、生物碱、酶、氨基酸、维生素和植物激素等活性物质[16]。研究表明，很多食用菌液体发酵的菌丝体多糖含量远高于子实体[17]。曾璇竹等[18]研究了香菇多糖发酵工艺的优化及其抗氧化活性，结果表明香菇发酵后多糖提取量和抗氧化活性显著升高。刘自尧等[19]研究发现，槐耳-板蓝根发酵后发酵体系中具有抗炎、抗肿瘤作用的多糖含量逐渐升高，且发酵后的多糖提取物能更明显抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞NO和TNF-α的分泌。

本课题组前期对金针菇进行发酵处理并从发酵金针菇中提取多糖，通过研究发现，相比FVP，发酵金针菇多糖(FFVP)分子聚集作用增强，单糖组成中甘露糖比例显著升高，同浓度下FFVP的抗氧化活性高于FVP[20]。然而，FVP和FFVP调节巨噬细胞炎症反应的作用及可能的机制还未知。本研究采用LPS诱导构建巨噬细胞炎症反应模型，探讨FVP和FFVP抑制巨噬细胞炎症反应的作用及机制，以期为合理利用金针菇提供理论基础，并为抑制炎症反应提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

FVP和FFVP，由本实验室提取纯化[20]；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，购自中国科学院细胞库；LPS，购自Sigma公司；杜氏磷酸缓冲液(DPBS)、胎牛血清、双抗、DMEM培养基、中性红溶液、脱脂奶粉、RIPA裂解液、BAY11-7082(NF-κB抑制剂)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、NO试剂盒、活性氧(ROS)试剂盒和CCK-8试剂盒，购自上海碧云天生物有限公司；一抗IκBα、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、β-肌动蛋白(β-actin)和二抗山羊抗兔免疫球蛋白G (goat anti-rabbit IgG)，购自上海优宁维生物科技股份有限公司；酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和定量PCR(q-PCR)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

细胞培养箱(Heracell-240i)，购自赛默飞世尔科技公司；荧光显微镜(ECLIPSE NI)，购自尼康仪器有限公司；酶标仪(Synergy-2)，购自泽泉国际集团有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养与处理

RAW264.7培养于含10%胎牛血清、1%双抗(100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素)和90% DMEM培养基的工作液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中。

1.3.1.1 LPS诱导RAW264.7炎症反应模型的建立

将处于对数生长期的RAW264.7按照1×105个/孔的密度接种于96孔板，每孔100 μL。将细胞培养板置于培养箱培养12 h，使细胞贴壁生长。取出细胞培养板，吸去培养基。每孔添加100 μL含LPS的工作液，设置LPS浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、1.5和2.0 μg/mL，培养箱中孵育24 h。

1.3.1.2 FVP/FFVP作用浓度的选择

细胞接种方式同1.3.1.1，每孔添加100 μL含FVP或FFVP的工作液，设置FVP或FFVP浓度分别为0、25、50、75、100、125和150 μg/mL，培养箱中孵育24 h。

1.3.1.3 FVP/FFVP处理LPS诱导的RAW264.7炎症反应模型

细胞接种方式同1.3.1.1，将细胞分为CON组(正常培养基)、LPS组(正常培养基+1 μg/mL LPS)、FVP组(正常培养基+1 μg/mL LPS+25、50或100 μg/mL FVP)和FFVP组(正常培养基+1 μg/mL LPS+25、50或100 μg/mL FFVP)，培养箱中孵育24 h。

1.3.1.4 FVP/FFVP及BAY11-7082处理LPS诱导RAW264.7炎症反应模型

细胞接种方式同1.3.1.1，将细胞分为CON组(正常培养基)、LPS组(正常培养基+1 μg/mL LPS)、LPS抑制组(正常培养基+1 μg/mL LPS+10 μmol/L BAY11-7082)(BAY11-7082的浓度参考Ghashghaeinia等[21]的研究)、FVP组(正常培养基+1 μg/mL LPS+100 μg/mL FVP)、FVP抑制组(正常培养基+1 μg/mL LPS+100 μg/mL FVP+10 μmol/L BAY11-7082)、FFVP组(正常培养基+1 μg/mL LPS+100 μg/mL FFVP)和FFVP抑制组(正常培养基+1 μg/mL LPS+100 μg/mL FFVP+10 μmol/L BAY11-7082)，培养箱中孵育24 h。

1.3.2 测定指标与方法

1.3.2.1 细胞活力

按1.3.1.1、1.3.1.2和1.3.1.3处理细胞，弃去上清液，用DPBS洗涤2次，将CCK-8与工作液按照1∶10的体积比配制CCK-8工作液，每孔加100 μL CCK-8工作液置于培养箱中继续培养1 h，在波长450 nm处测定吸光度(OD)值[22]，按下式计算细胞活力：

R1(%)=100×(ODT-ODB)/(ODC-ODB)。

式中：R1为细胞活力；ODT为试验组OD值；ODB为空白组OD值；ODC为对照组OD值。

1.3.2.2 ROS与NO含量

按1.3.1.3处理细胞，处理完成后，离心取上清，按试剂盒说明书测定各组上清液中的NO含量[23]。细胞用DPBS洗涤2次，将荧光探针2’,7’-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)试剂与工作液按照1∶1 000的体积比配制DCFH-DA工作液，然后每孔加2 mL(6孔板)和100 μL(96孔板)DCFH-DA工作液，培养箱中孵育20 min。用荧光显微镜观察6孔板各孔的荧光并拍照，用酶标仪测定96孔板各孔的荧光强度[24]，根据下式计算ROS含量：

R2(%)=100×(FIT-FIB)/(FIC-FIB)。

式中：R2为ROS含量；FIT为试验组荧光强度；FIB为空白组荧光强度；FIC为对照组荧光强度。

1.3.2.3 吞噬能力

按1.3.1.3处理细胞，培养24 h后弃培养基，每孔加入50 μL的0.05%中性红溶液，培养4 h后弃去中性红，DPBS洗3次，加入100 μL细胞裂解液，室温放置2 h，用酶标仪测定540 nm处OD值，根据下式计算吞噬指数：

R3(%)=100×ODE/ODC。

式中：R3为吞噬指数；ODE为试验组OD值；ODC为对照组OD值。

1.3.2.4 炎症因子含量

按1.3.1.3处理细胞，培养结束后收集上清液离心，按照ELISA试剂盒说明书测定IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α含量[25]。

1.3.2.5 炎症因子mRNA相对表达量

按1.3.1.3处理细胞，培养结束后收集细胞，使用TRIzol法提取总RNA，加入RNAase-Free水，应用紫外法测定RNA的纯度和浓度。按试剂盒说明书进行反转录、扩增，以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的mRNA相对表达量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息见表1。

1.3.2.6 Western blot

BAY11-7082是一种NF-κB抑制剂，抑制TNF-α诱导的IκBα磷酸化(p-IκBα)，可以完全且特异性地废除NF-κB的DNA结合，下调细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达[26]。为研究FVP和FFVP通过NF-κB-NLRP3信号通路抑制巨噬细胞炎症反应的机制，选用BAY11-7082作为NF-κB抑制剂开展Western blot。

按1.3.1.4处理细胞，培养结束后每孔加入200 μL的RIPA裂解液(含1 mmol/L的PMSF)，4 ℃裂解30 min，离心取上清液。使用BCA法测定蛋白浓度，将上清液与5×十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液按照体积比4∶1混合后置于沸水中煮3～5 min。上样完成后在80(20 min)、120 V(60 min)恒定电压条件下电泳。电泳结束后，将目标蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。室温下，5%的脱脂奶粉封闭4 h，一抗(IκBα，1∶1 000稀释；NLRP3，1∶1 500稀释；Caspase-1，1∶800稀释；IL-1β，1∶400稀释；β-actin，1∶5 000稀释)孵育，4 ℃振荡过夜。次日于室温下二抗(goat anti-rabbit IgG，1∶5 000稀释)孵育1 h，TBST液洗膜(3次，每次10 min)。加入ECL化学发光液，在凝胶成像系统中显影，利用Image-Pro Plus 6.0软件进行量化。

表1 引物信息

1.4 数据处理与统计分析

每组数据重复3次，取平均值。采用SPSS 18.0软件的单因素方差分析程序进行数据分析，并用LSD法进行多重比较，结果以平均值±标准误(mean±SE)的形式表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 细胞活力

LPS对RAW264.7细胞活力的影响如图1-A所示。相比LPS浓度为0时，LPS浓度等于或超过0.5 μg/mL时细胞活力显著降低(P<0.05)；LPS浓度为1.0 μg/mL时细胞活力为LPS浓度为0时的38.52%，再继续升高LPS浓度，细胞活力没有显著变化(P>0.05)。

FVP/FFVP对RAW264.7细胞活力的影响如图1-B所示。在FVP/FFVP浓度低于100 μg/mL时细胞活力呈升高趋势，并呈剂量依赖性；当FVP/FFVP浓度高于100 μg/mL时细胞活力出现下降趋势，表明FVP和FFVP浓度在100 μg/mL以上时对细胞存在一定毒性作用。浓度为100和150 μg/mL时，FFVP组的细胞活力显著高于FVP组(P<0.05)。因此本研究选取1 μg/mL的LPS和25、50、100 μg/mL的FVP/FFVP进行后续试验。

FVP/FFVP对LPS诱导RAW264.7细胞活力的影响如图1-C所示。LPS组的细胞活力为CON组的39.41%(P<0.05)；与LPS组相比，25 μg/mL FVP/FFVP处理后，细胞活力均无显著变化(P>0.05)，50和100 μg/mL FVP/FFVP处理后，细胞活力显著升高(P<0.05)；浓度为100 μg/mL时，FFVP组细胞活力显著高于FVP组(P<0.05)。

2.2 ROS和NO含量

FVP/FFVP对LPS诱导RAW264.7 ROS和NO含量的影响如图2所示。相比CON组，LPS组的ROS和NO含量极显著升高(P<0.01)；FVP/FFVP处理后，ROS和NO含量出现降低趋势，并呈剂量依赖性。相同浓度下，FFVP组的NO含量均低于FVP组(P>0.05)。浓度为100 μg/mL时，FFVP组的ROS含量显著低于FVP组(P<0.05)；其他浓度下，FFVP组的ROS含量均低于FVP组(P>0.05)。

图A：LPS对RAW264.7细胞活力的影响。数据柱标注不同字母表示差异显著(P<0.05)。图B：FVP/FFVP对RAW264.7细胞活力的影响。FFVP组数据柱标注“#”表示与同浓度的FVP组相比差异显著(P<0.05)。图C：FVP/FFVP对LPS诱导RAW264.7细胞活力的影响。LPS组数据柱标注“**”表示与CON组相比差异极显著(P<0.01)。除CON组外，数据柱标注不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 吞噬能力

FVP/FFVP对LPS诱导RAW264.7吞噬能力(以吞噬指数表示)的影响如图3所示。相比CON组，LPS组的吞噬能力显著下降(P<0.01)，添加FVP和FFVP后，吞噬能力呈升高趋势，存在剂量依赖性，100 μg/mL的FFVP处理细胞后吞噬能力最高。在浓度为50和100 μg/mL时，FFVP组的吞噬能力显著高于FVP组(P<0.05)。

2.4 炎症因子分泌及其基因表达

RAW264.7培养上清液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的含量见表2。与CON组相比，LPS组上清液中上述4种炎症因子的含量均极显著增加(P<0.01)，而添加FVP/FFVP后上清液中这4种炎症因子的含量均出现下降趋势，并呈剂量依赖性。在浓度为50 μg/mL时，FFVP组的IL-18含量显著低于FVP组(P<0.05)；在浓度为100 μg/mL时，FFVP组的IL-6和TNF-α含量显著低于FVP组(P<0.05)。

FVP/FFVP对LPS诱导RAW264.7炎症因子基因表达的影响见图4。与CON组相比，LPS组IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01)，添加FVP/FFVP后上述炎症因子的mRNA相对表达量存在下降趋势。FVP和FFVP对IL-1βmRNA相对表达量的影响差异最大，3个浓度下2组间均存在显著差异(P<0.05)。FVP组和FFVP组的IL-18 mRNA相对表达量在浓度为100 μg/mL时差异显著(P<0.05)。

图A和图C：FVP/FFVP对LPS诱导RAW264.7 ROS含量的影响；图B：FVP/FFVP对LPS诱导RAW264.7 NO含量的影响。

图3 FVP/FFVP对LPS诱导RAW264.7

2.5 p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表达

p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表达如图5所示。相比CON组，LPS组的p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量极显著升高(P<0.01)。相比LPS组，单独以BAY11-7082、FVP或FFVP处理后，p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)。相比单独以FVP或FFVP处理，同时以BAY11-7082和FVP或FFVP处理后，p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。其中，FFVP抑制组与FFVP组p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量的比例分别为0.12∶0.48、0.12∶0.61、0.08∶0.47和0.07∶0.43。相比FVP组，FFVP组的p-IκBα、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)。

3 讨论

本研究结果表明，LPS处理RAW264.7后ROS和NO含量极显著升高，吞噬能力极显著降低，IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α含量及其mRNA相对表达量极显著升高；FVP/FFVP处理后，ROS和NO含量以及上述炎症因子的含量和mRNA相对表达量出现降低趋势，吞噬能力呈升高趋势，并呈剂量依赖性。Zhao等[27]研究FVP免疫激活的体内外功能时发现FVP作为一种激活剂可诱导RAW264.7巨噬细胞的M1极化。在动物试验中发现，FVP可以提高小鼠结肠组织免疫调节功能和抗炎活性。苗月[28]研究了FVP对RAW264.7的免疫应答作用，结果表明FVP能显著促进RAW264.7的增殖，提高其吞噬能力，倒置显微镜下观察到FVP处理后RAW264.7的形态由静息变为激活状态，上述研究结果与试验结果一致。

表2 FVP/FFVP对LPS诱导RAW264.7炎症因子分泌的影响

图4 FVP/FFVP对LPS诱导RAW264.7炎症因子基因表达的影响

Western blot结果表明，LPS处理RAW264.7后p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量极显著升高；相比LPS组，单独以BAY11-7082、FVP或FFVP处理后，p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量显著降低；相比单独以FVP或FFVP处理，同时以BAY11-7082和FVP或FFVP处理后，p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量显著降低。研究表明，多糖可以通过NF-κB信号通路调控炎症[29]。Shen等[30]研究发现，木槿多糖可以抑制NF-κB信号通路中IκBα和p65的蛋白表达，进而增强RAW264.7的免疫活性。Gan等[31]的研究表明，枸杞多糖通过上调Toll样受体4(TLR4)的蛋白表达来减轻四氯化碳(CCl4)诱导的氧化损伤、炎症反应和NF-κB信号通路的表达。NF-κB信号通路在转录水平上可以启动NLRP3炎症小体[6,32]，其蛋白表达的升高可增强NLRP3蛋白的表达[33]。Li等[34]在小鼠肠道和肠上皮细胞中均检测到NF-κB与NLRP3存在正相关关系。除此之外，多种抗氧化剂都有抑制NF-κB-NLRP3信号通路的作用[35]。ROS的过量产生是导致NF-κB-NLRP3信号通路激活的一个重要原因[36-37]。根据Harijith等[38]的报道，ROS是在线粒体氧化磷酸化过程中由氧还原产生的高活性分子，被认为是NLRP3炎症小体激活的常见触发因素。韩晨阳等[39]研究了樟芝多糖抑制6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的多巴胺能神经元细胞炎症反应的作用机制，发现樟芝多糖可以通过抑制ROS的分泌降低NF-κB-NLRP3信号通路的活化，进而调节6-OHDA诱导多巴胺能神经元的炎症反应。本研究中，100 μg/mL的FVP/FFVP处理巨噬细胞炎症模型后，ROS含量显著降低，NF-κB-NLRP3信号通路中p-IκBα、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量显著降低，与前人研究结果一致。

p-IκBα：磷酸化核转录因子-κB抑制蛋白α phosphorylated nuclear factor-κB inhibitor α；IκBα：核转录因子-κB抑制蛋白α nuclear factor-κB inhibitor α；NLRP3：NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3 NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3；Caspase-1：半胱天冬蛋白酶-1 cysteinyl aspartate specific proteinase-1；IL-1β：白细胞介素-1β interleukin-1β；β-actin：β-肌动蛋白；LPS：脂多糖 lipopolysaccharide；FVP：金针菇多糖 Flammulina velutipes polysaccharide；FFVP：发酵金针菇多糖 fermented Flammulina velutipes polysaccharide。

FVP和FFVP的浓度为25 μg/mL时，FFVP组细胞上清液中IL-6含量显著低于FVP组；浓度为50 μg/mL时，FFVP组的吞噬能力显著高于FVP组，IL-18含量显著低于FVP组；浓度为100 μg/mL时，FFVP组的ROS、TNF-α含量，IL-18 mRNA相对表达量以及IκBα、Caspase-1和IL-1β的蛋白相对表达量显著低于FVP组。本课题组前期研究发现，相比FVP，FFVP呈板状，分子聚集作用增强，单糖组成比例改变，其中甘露糖比例显著升高；同浓度下FFVP的抗氧化活性高于FVP，且浓度越高差异越大[20]。一方面，发酵通过改变FVP的结构增强其抗炎活性。研究报道多糖的抗炎作用与多糖链构象和分子结构等都有关[40]。扫描电镜下FFVP呈板状，说明其分支较多，且聚集键很强[41]。原子力显微镜下FFVP的分子聚合度高于FVP，这是由于羟基的强烈相互作用而产生的[42]。另一方面，发酵通过改变FVP的单糖组成增强其抗炎活性。FFVP中甘露糖比例升高，甘露糖属于功能性糖，具有较高的抗炎活性。吴惠娟等[43]研究了甘露糖对RAW264.7炎症反应的调控及其机制，发现甘露糖可显著抑制LPS诱导的IL-1β、IL-12、TNF-α和IL-6的mRNA及蛋白表达，并抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、p65和细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化水平的增加，甘露糖单独处理可抑制AKT、信号转导和转录激活因子3(STAT3)和p65的磷酸化。因此，本研究中FFVP抗炎效果优于FVP的可能原因包括FFVP中多糖链间的强交互作用、多糖分子的高度聚集以及甘露糖比例的升高。