OIP5-AS1调控miR-375／APC轴抑制胰腺腺泡细胞焦亡的作用及临床意义

唐运成，马瑞，彭禹，罗明

十堰市太和医院急诊科，湖北省十堰442000

急性胰腺炎（acute pancreatitis， AP）的发生发展一直是外科领域的研究热点［1］。在AP 的早期阶段，胰蛋白酶激活、过量的氧自由基和促炎性细胞因子导致腺泡细胞的损伤和死亡［2］。腺泡细胞的死亡形式包括凋亡、坏死和焦亡［3］。焦亡是一种由胱天蛋白酶（caspase）介导的程序性细胞死亡，在AP 的腺泡细胞中存在caspase-1 激活，提示焦亡与AP 有关［4］。miR-375 在AP 中会促进腺泡细胞的炎症反应与凋亡［6］。活化蛋白C （activated protein C，APC）是一种内源性抗凝剂，具有抗血栓、纤溶和抗炎作用，且对AP 有治疗效果［7］。目前，越来越多的长链非编码核糖核酸被发现在AP 进展中发挥调控作用［5］。但Opa 相互作用蛋白5-反义RNA 1 （Opa interacting protein 5-antisense RNA1， OIP5-AS1）在AP 中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探讨OIP5-AS1 充当miR-375 的竞争性内源RNA 对胰腺腺泡细胞焦亡的调控作用，为老年AP的诊断和治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂

Lipofectamine 3000 和TRIzol 试剂（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；miR-375 模拟物（mimic）、OIP5-AS1 过表达载体（pcDNA-OIP5-AS1）、靶向APC小干扰RNA （si-APC）及各自对照物（广州云舟生物科技有限公司）；ELISA 和LDH 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；FAM FLICA caspase-1 活性检测试剂盒（上海联迈生物工程有限公司）；实验所有抗体（英国Abcam 公司）；PCR 引物（上海吉玛制药技术有限公司）；双荧光素酶基因检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；FISH 试剂盒（广州伯信生物科技有限公司）；ECL 化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 生物信息学分析

从NCBI 获取GEO 芯片数据，选择GSE42455 分析AP 的差异表达miRNA。通过miRWalk、RNA22 和StarBase 在线预测网站预测miR-375 的上／下游靶点。DAVID 数据库用于基因本体（gene ontology， GO）和京都基因与基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析。

1.3 细胞培养与转染

大鼠胰腺腺泡AR42J 细胞购自中国科学院细胞库。37℃、5%CO2条件下，于20%胎牛血清的F-12K培养基中培养AR42J 细胞。24 h 后，AR42J 细胞与100 nmol雨蛙素孵育0、4、8、12、24 h。用Lipofectamine 3000 将miR-375 mimic、pcDNA-OIP5-AS1 和si-APC转染AR42J 细胞。24 h 后，加入100 nmol 雨蛙素处理AR42J 细胞24 h，刺激后提取RNA 或蛋白进行后续分析。

细胞分为8 组：Control 组（AR42J 细胞不做任何处理）、Caerulein 组（AR42J 细胞经雨蛙素刺激）、Caerulein+pcDNA-NC 组（AR42J 细胞经雨蛙素刺激且转染 pcDNA-NC）、 Caerulein + pcDNA-OIP5-AS1 组（AR42J 细胞经雨蛙素刺激且转染pcDNA-OIP5-AS1）、 Caerulein + pcDNA-OIP5-AS1 + miR-NC 组（AR42J 细胞经雨蛙素刺激且转染pcDNA-OIP5-AS1和miR-NC）、Caerulein + pcDNA-OIP5-AS1 + miR-375 mimic 组（AR42J 细胞经雨蛙素刺激且转染pcDNAOIP5-AS1 和miR-375 mimic）、 Caerulein + pcDNAOIP5-AS1 +si-NC 组（AR42J 细胞经雨蛙素刺激且转染pcDNA-OIP5-AS1 和si-NC）、Caerulein + pcDNAOIP5-AS1 +si-APC组（AR42J 细胞经雨蛙素刺激且转染pcDNA-OIP5-AS1 和si-APC）。

1.4 ELISA［8］

培养基在雨蛙素处理24 h 后收集，根据ELISA 说明书测量促炎性细胞因子白细胞介素-18 （interleukin-18， IL-18）和IL-1β 的分泌。

1.5 流式细胞术［9］

收集AR42J 细胞于FLICA 溶液中培养1 h，缓冲液洗涤3 次。以CytoFLEX 流式细胞仪分析信号，通过CytExpert2.3 分析数据，测定caspase-1 活性。

1.6 Western blot［10］

检测NLR 家族pyrin 域蛋白3 （NOD-likereceptor family pyrin domain-containing protein 3， NLRP3）和消皮素D （gasdermin D， GSDMD）的蛋白表达。RIPA裂解液裂解AR42J 细胞，10% SDS-PAGE 分离蛋白质，并转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭。4℃条件下，将膜与NLRP3 （1 ∶1000）、GSDMD （1 ∶1000）和caspase-1 （1∶1000）的一抗孵育过夜，洗涤后与二抗孵育2 h。GAPDH作为内参，用ECL 化学发光试剂盒和ImageJ 软件定量分析蛋白条带。

1.7 LDH 测定［11］

根据试剂盒说明书，测量雨蛙素刺激后AR42J 细胞培养上清中LDH 的释放。

1.8 实时荧光定量PCR （qRT-PCR）

使用TRIzol 试剂从培养的AR42J 细胞中分离总RNA。通过逆转录试剂盒合成cDNA，并进行PCR 扩增。U6 和GAPDH作为内参，用2-ΔΔCt法计算相对表达。见表1。

表1 引物序列

1.9 双荧光素酶报告实验

将含有miR-375 野生型（wild type， WT）或突变型（mutant， MUT）结合位点的OIP5-AS1 或APC3′UTR 片段扩增，并插入pMIR 报告荧光素酶报告载体，命名为OIP5-AS1-WT、OIP5-AS1-MUT、APC-WT 和APC-MUT。200 ng 荧光素酶报告载体和20 μmol miR-375 mimic 或对照物使用Lipofectamine 3000 共转染细胞。48 h 后，使用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性。

1.10 FISH

室温下，AR42J 细胞在4% 多聚甲醛中固定15 min，PBS 洗涤。用0.5%Triton X-100 在4℃下渗透细胞15 min。地高辛标记的OIP5-AS1 探针或对照FISH 探针在55℃下培养AR42J 细胞4 h，并用2 ×PBS 洗涤10 min。HRP 标记的地高辛二抗检测信号，DAPI 用于核染色，采用激光共聚焦显微镜获得图像。

1.11 统计学分析

使用SPSS 22. 0 进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学预测

AP 中15 个miRNA 显著上调，16 个miRNA 显著下调，根据既往研究［6］选择miR-375 进行后续分析。RNA22 在线靶向关系预测网站显示，miR-375 和OIP5-AS1 存在特异性结合位点。在RNA22、StarBase 和miRWalk 获取miR-375 的下游靶基因并取交集，共有1 172个交集靶基因。将这些靶基因通过DAVID 网站进行GO 和KEGG 功能富集分析，结果发现了细胞增殖相关通路（GO：0008285）和干细胞相关通路（hsa04550）。将富集在这2 个通路中的基因取交集，交集结果为REST、APC、SMAD2、JARID2、LIF和KLF4。根据先前的研究［7］，选择APC进行后续分析。见图1。

图1 生物信息学工具预测结果

2.2 AP 细胞模型中OIP5-AS1、APC 和miR-375 的表达

在0、4、8、12、24 h 采用qRT-PCR 检测发现，AR42J 细胞中OIP5-AS1 和APC的水平随刺激时间延长而逐渐降低，而miR-375 的水平随刺激时间延长而逐渐升高。见图2。

图2 AP 细胞模型中OIP5-AS1、miR-375 和APC 的表达

2.3 过表达OIP5-AS1 减轻雨蛙素诱导的细胞损伤

与Caerulein 组比较，pcDNA-OIP5-AS1 转染显著上调了OIP5-AS1 的水平。过表达OIP5-AS1 能抑制IL-18和IL-1β 的分泌，减少LDH 的释放，降低caspase-1 的活性，并抑制GSDMD、NLRP3 和caspase-1 的蛋白表达水平。提示过表达OIP5-AS1 可显著减轻雨蛙素诱导的AR42J 细胞焦亡。见图3。

图3 过表达OIP5-AS1 减轻雨蛙素诱导的细胞损伤

2.4 OIP5-AS1 与miR-375 存在靶向关系

FISH 结果显示，OIP5-AS1 主要定位于细胞质中。双荧光素酶报告实验证实了OIP5-AS1 和miR-375 的互作用关系，miR-375 mimic 可显著抑制OIP5-AS1-WT的荧光活性。此外，雨蛙素刺激AR42J 细胞后miR-375 显著上调，而过表达OIP5-AS1 后miR-375 显著下调。见图4。

2.5 过表达miR-375 可加重OIP5-AS1 减轻的细胞损伤

将pcDNA-OIP5-AS1 和miR-375mimic 共转染AR42J 细胞，用雨蛙素刺激AR42J 细胞24 h。pcDNAOIP5-AS1 抑制的miR-375 在转染miR-375 mimic 后显著升高。炎性因子和LDH 水平测定结果显示，过表达OIP5-AS1降低的 IL-18、 IL-1β 和 LDH 被 miR-375 mimic升高。流式细胞术分析显示，过表达miR-375 显著提高了caspase-1 的活性。此外，GSDMD、NLRP3 和 caspase-1 的蛋白水平在转染 miR-375mimic 后显著升高。表明过表达miR-375 可部分逆转OIP5-AS1 减轻的雨蛙素诱导的AR42J 细胞损伤。见图5。

2.6 APC 是miR-375 的靶基因

miR-375 mimic 显著降低APC-WT 的荧光素酶活性，证实了APC是miR-375 的靶基因。qRT-PCR 检测显示，AR42J 细胞中的APC在雨蛙素刺激后下调，过表达OIP5-AS1 后APC显著上调，而过表达miR-375后APC再次下调。见图6。

图6 OIP5-AS1 是miR-375 的海绵

2.7 沉默APC 能部分逆转过表达OIP5-AS1 对腺泡细胞的保护作用

pcDNA-OIP5-AS1 显著提高的APC水平在转染si-APC后降低。ELISA 和LDH 检测结果显示，过表达OIP5-AS1 显著抑制的IL-18、IL-1β 和LDH 在沉默APC后显著升高。Caerulein + pcDNA-OIP5-AS1 +si-APC组的caspase-1 活性显著升高。Western blot 结果显示，pcDNA-OIP5-AS1 显著降低了GSDMD、NLRP3 和caspase-1 的蛋白水平，而沉默APC部分逆转了这一结果。表明OIP5-AS1 可通过上调APC的表达显著减轻雨蛙素诱导的AR42J 细胞焦亡。见图7。

图7 沉默APC 能够部分逆转过表达OIP5-AS1 对腺泡细胞的保护作用

3 讨论

雨蛙素是一种胆囊收缩素的类似物，用其诱导AP操作便捷且周期短，因此已成为目前AP 造模的最常用方式［12］。本研究采用雨蛙素刺激AR42J 细胞构建AP 细胞模型，证实了OIP5-AS1 通过调控miR-375／APC轴进而影响AP 进展的作用。

既往研究表明，OIP5-AS1 对缺氧诱导的小胶质细胞／巨噬细胞炎症和氧化应激损伤具有保护作用［13］，在骨关节炎和类风湿关节炎中也具有抗炎作用［14］。但OIP5-AS1 在AP 中的作用尚未报道。本次研究发现，雨蛙素处理AR42J 细胞后，OIP5-AS1 的表达呈时间依赖性降低，故将OIP5-AS1 过表达载体转染AR42J细胞探究OIP5-AS1 在AP 细胞模型中的作用。细胞焦亡过程具有caspase-1 依赖性，caspase-1 通过GSDMD 诱发焦亡，caspase-1 前体可与NLRP3 等模式识别受体结合为炎症小体，随后刺激细胞释放炎性因子IL-8和IL-1β 等［15］。因此，本研究通过ELISA 检测AR42J 细胞培养上清中的IL-8 和IL-1β，结果显示过表达OIP5-AS1 可显著降低雨蛙素诱导升高的IL-8 和IL-1β。LDH 的释放进一步验证细胞焦亡的发生［16］，过表达OIP5-AS1 显著降低了LDH 的释放。此外，雨蛙素显著提高的caspase-1 活性被上调的OIP5-AS1 抑制，过表达OIP5-AS1 能显著抑制焦亡相关蛋白的表达。上述结果表明，OIP5-AS1 可有效抑制雨蛙素诱导的AR42J 细胞焦亡。

为验证OIP5-AS1 在AP 进展中的分子机制，本研究进一步探究了其可能调控的靶点。既往研究表明，miR-375 在动脉粥样硬化中异常高表达，可加重炎症反应［17］。qRT-PCR 检测结果显示，miR-375 在雨蛙素刺激的AR42J 细胞中上调，且OIP5-AS1 可负调控miR-375 的表达。此外，过表达miR-375 可促进IL-8、IL-1β 和LDH 的释放，激活caspase-1 的活性，并提高焦亡相关蛋白GSDMD、NLRP3 和caspase-1 的表达，对OIP5-AS1 减轻的AR42J 细胞损伤起抑制作用。提示OIP5-AS1 可能通过下调miR-375 表达对AP 中的腺泡细胞起保护作用。

多种在线靶向关系预测网站筛选得到miR-375 的下游靶基因，对靶基因做GO 和KEGG 分析得到与AP进展相关的细胞增殖通路。而干细胞近年来也被逐渐应用于AP 的治疗，因此将增殖和干细胞通路纳入研究，对交集基因进行分析后，将在AP 中有相关研究的APC作为本研究中miR-375 的靶基因［7］。APC作为一种抗凝血浆丝氨酸蛋白酶，具有很强的细胞保护和抗炎活性作用［18］。能保护胰腺免受损伤，改善疾病进展［19］。本研究发现APC在雨蛙素诱导的AP 细胞模型中表达降低。APC是miR-375 的靶基因。过表达OIP5-AS1 可抑制IL-8、IL-1β 和LDH 的释放，降低caspase-1 的活性，并降低焦亡相关蛋白GSDMD、NLRP3和caspase-1 的表达，而沉默APC可部分逆转这一结果。提示沉默APC可加速AP 中腺泡细胞焦亡，OIP5-AS1 可能通过上调APC的表达，抑制AP 腺泡细胞焦亡。

本研究从腺泡细胞焦亡影响AP 进展的角度首次发现，OIP5-AS1 通过海绵吸附miR-375 上调APC的表达，保护AP 中的腺泡细胞免受焦亡。OIP5-AS1／miR-375／APC有望作为有效作用靶点应用于AP 的治疗。