医用臭氧膀胱灌注治疗大鼠膀胱炎的疗效及安全性观察

沙可夫，廖利民，刘铁军，王莹，于春虎，曲文龙

1 首都医科大学康复医学院 中国康复研究中心泌尿外科，北京100068；首都医科大学附属北京康复医院泌尿外科

近年来随着生活环境变化，膀胱炎在感染性疾病中的发病率仅次于肺部感染，并呈现日益升高的趋势[1-2]；而且，该病具有延绵难愈的特点，甚至可波及肾脏致其受损。因此，加强膀胱炎发生发展及治疗的相关研究成为当前泌尿外科着重关注的热点[3]。据临床观察并结合大量资料分析显示，致病性大肠埃希菌是导致膀胱炎发生发展的常见病原菌[4]，抗菌药物虽能在一定程度满足临床治疗所需，但近年来受抗生素广泛使用及肠杆科细菌产超广谱β-内酰胺酶、碳氢霉烯酶等作用的影响，肠杆科致病菌的多重耐药性逐步升高[5]。研究显示，大肠埃希菌对美罗培南、亚胺培南的耐药率已分别达9.80%、7.30%[6]。这直接导致抗生素选择的复杂化、风险化，治疗效果降低，患者住院时间延长、治疗费用增加。由此可见，抗生素的多重耐药性极大限制了膀胱炎的治疗手段，增加了临床治疗难度，所以亟需一种更为安全、高效的治疗手段解决目前问题[7]。医用臭氧作为一种强效氧化剂，因其具有抑制炎症、镇痛效果显著并能激活细胞新陈代谢、促进创面愈合等功效，常被用于血管性疾病、感染性疾病、软组织疾病和口腔疾病的治疗且疗效满意[8]。但是，将其作为膀胱炎治疗手段的报道及研究少见[9]。2019年3月—2020年4月，本研究建立膀胱炎大鼠模型，通过医用臭氧对其进行干预，总结医用臭氧作用效果、浓度使用安全窗及在减轻氧化应激、炎症反应中的作用，为临床推广使用提供可参考的循证依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选取96只清洁级(SPF)同月龄雌性健康Wistar大鼠[上海中医药大学动物实验学部提供，动物许可证号SCXK(沪)2020-0010]，体质量240～260 g；饲养环境：温度22～27 ℃、湿度40%～60%。动物实验获得动物伦理委员会批准(批准文号：2019bkkyLW004)，全部实验动物均按照国家科技部《关于善待实验动物指导性意见》[10]进行合理使用。

1.1.2 主要试剂和仪器 10%水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)，生理盐水(徐州莱恩药业有限公司)，乌拉坦(上海山浦化功能有限公司)；大肠杆菌菌株ATCC35218(华中科技大学同济医学院微生物实验室)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)及DAB显色试剂盒(上海佳和生物科技有限公司)；臭氧发生器(德国赫美斯)，JW-3021HR 型高速台式冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)，JEOM-100CX 型透射电子显微镜(日本电子公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 医用臭氧水配制 采用臭氧发生器使浓度80%的臭氧气体分别以体积比1∶2、1∶1、1.5∶1溶解于无菌双蒸馏水中，配制成质量浓度分别为10、20、30 μg/mL的臭氧水，即配即用。

1.2.2 动物分组与造模干预处理 分组采用按随机数表法，取72只大鼠分为正常组(Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc亚组各12只)和治疗组(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc亚组各12只)，另24只分为对照组和模型组各12只。模型组和治疗组均经尿道灌注大肠杆菌悬浮液进行膀胱炎造模，正常组和对照组不进行造模处理。造模方法：以10%水合氯醛按3 mL/kg予以腹腔麻醉，麻醉成功后定位大鼠膀胱；轻柔按压膀胱促进尿液排尽，对会阴、尿道外口及腹部予以消毒处理；采用1 mL注射器吸取足量细菌悬浮液，连接小儿静脉留置针(24 G)；将小儿静脉留置针自尿道外口插入膀胱，于30 s内缓慢注入细菌悬液50 μL后退出导尿管。成模评定：7 d后各组随机抽取2只，予以断颈处死；切开腹腔，将膀胱取出且剪开，采用无菌拭子涂擦膀胱内壁行细菌培养；同时将剪下的部分膀胱组织予以苏木精—伊红(HE)染色，制作病理切片。结果造模组和治疗组细菌培养呈阳性，可见膀胱黏膜显著水肿、增厚，且黏膜、基质存在单核炎症细胞浸润、聚集及毛细血管充血、出血等，膀胱炎大鼠造模成功[11]。正常组和对照组细菌培养呈阴性，膀胱黏膜组织未见明显病理改变。正常组的Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc亚组和治疗组Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc亚组分别以10、20、30 μg/mL医用臭氧水1 mL行膀胱灌注且保留30 min，模型组和对照组以等量生理盐水行膀胱灌注，各组均连续灌注7 d。

1.2.3 医用臭氧疗效评价 模型组和治疗组干预前后收集尿液，行尿液全项检测。尿液细菌计数降至正常范围内为痊愈，细菌计数减少50%及以上为有效，细菌计数减少50%以下为无效[11]。总有效率=(痊愈+有效)只数/(痊愈+有效+无效)只数×100%。

1.2.4 尿流动力学检查 模型组、治疗组收集完干预后的尿液，与对照组同时行尿流动力学检查。用25%乌拉坦2 mL/kg腹腔麻醉，经尿道插入直径1 mm硬膜外导管至膀胱，导管经三通阀分别与尿动力仪压力传感器及微量灌注泵相连；轻压腹部，排空膀胱并标记为0点[12]；以0.1 mL/min速度将生理盐水灌注膀胱，并完成排尿间隔、膀胱容量、基础膀胱压力及最高膀胱压力的测定。连续测定3次，取平均值。

1.2.5 膀胱肌层组织TNF-α、IL-6、SOD、GSH-PX检测 将模型组、治疗组、对照组大鼠予以断颈处死，切开腹腔并剪开膀胱，取新鲜膀胱肌层组织100 mg；加RIPA裂解液900 μL，冰浴匀浆至组织完全裂解；4 ℃下以2 000 g离心20 min，取上清液。ELISA法检测膀胱组织中的TNF-α、IL-6浓度及SOD、GSH-PX活性，均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.6 医用臭氧水浓度使用安全性评价 将正常组大鼠予以断颈处死，切开腹腔并剪开膀胱，取膀胱组织样本；采用石蜡包埋法行HE染色固定，显微镜下观察膀胱黏膜、细胞等病理学变化。

2 结果

2.1 医用臭氧疗效评价结果 治疗组Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc总有效率依次增高且均高于模型组(P<0.05)，但各亚组间差异均无统计学意义。见表1。

表1 医用臭氧疗效评价

2.2 模型组、治疗组与对照组尿流动力学参数比较 三组基础膀胱压力、最高膀胱压力差异无统计学意义，而排尿间隔、膀胱容量差异有统计学意义；治疗组内Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc排尿间隔及Ⅱb、Ⅱc膀胱容量逐渐升高，且均高于模型组，但均低于对照组(P均<0.05)。见表2。

表2 模型组、治疗组与对照组尿流动力学参数比较

2.3 模型组、治疗组与对照组膀胱肌层组织TNF-α、IL-6、SOD、GSH-PX检测结果比较 各组膀胱肌层组织TNF-α、IL-6、SOD、GSH-PX检测结果差异有统计学意义，治疗组内Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc膀胱肌层组织TNF-α、IL-6表达量逐渐降低而SOD、GSH-PX活性逐渐增高，且TNF-α、IL-6表达量均低于模型组而SOD、GSH-PX活性均高于模型组，但TNF-α、IL-6表达量均高于对照组而SOD、GSH-PX活性均低于对照组(P均<0.05)。见表3。

表3 模型组、治疗组与对照组膀胱肌层组织TNF-α、IL-6、SOD、GSH-PX检测结果比较

2.4 医用臭氧水浓度使用安全性评定结果 正常组Ⅰa、Ⅰb均未出现明显病理改变，Ⅰc中1只出现明显病理改变。病理改变为镜下可见黏膜水肿，毛细血管扩张，组织内可见炎症现象，存在炎症细胞浸润延伸至肌层。

3 讨论

近年来，有大量动物实验及临床研究表明氧化应激和炎症反应参与了膀胱炎的发生发展[13]。其中，氧化应激作为氧化物质与抗氧化物质间的对抗反应，被视为是启动和加速炎症反应的催化剂和有效媒介[14]；一旦炎症反应被启动和加速，就能诱发膀胱组织内TNF-α、IL-6等炎症介质大量产生与过度表达，致使膀胱内局部组织微环境异常，继而引起膀胱组织损伤，影响其正常功能[15]。由此可见，促进抗氧化物质表达，有利于遏制和减轻氧化应激反应，继而有助于阻断炎症级联反应对膀胱组织的损伤过程，可视为治疗膀胱炎的有效途径之一[16-17]。

医用臭氧为医用纯氧制备的臭氧与纯氧的混合气体，能够有效改善局部组织微循环，影响毛细血管扩张状态，增加组织细胞膜通透性，提升血流速度，继而增加组织供氧、减少炎性渗出[18]；同时局部组织供氧能力的提升，有利于促进受损细胞快速完成自身修复与增殖[19]。另外，医用臭氧存在着非特异性和特异性抑制病原微生物生长等作用，使其具有良好的抗感染特性[20]。已有研究发现，臭氧注射治疗对创伤后无菌炎症反应有明显的抑制作用，且能促进创伤软组织的修复[21]。孙妞妞等[22]研究发现，臭氧水对输卵管及宫颈的炎症具有良好的杀菌效果。而赵超莉等[23]研究显示，臭氧气浴30 min和60 min对大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等的杀菌率均达到100%。以上研究均提示，医用臭氧具有强大的杀菌作用。基于此，本研究通过对不同灌注浓度医用臭氧治疗大鼠膀胱炎模型的效果以及对抗氧化应激指标(SOD、GSH-PX)和炎症反应指标(TNF-α、IL-6)的影响进行分析，旨在为医用臭氧治疗膀胱炎的可行性提供依据，并初步探讨其作用机制。结果显示，不同灌注浓度医用臭氧尤其是20、30 μg/mL时治疗膀胱炎大鼠的总有效率及排尿间隔、膀胱容量均高于模型组，体现了医用臭氧良好的杀菌作用，并能有效改善尿频、尿急等症状。对炎症反应的影响方面，治疗组随着灌注浓度的增加，大鼠膀胱肌层组织TNF-α、IL-6表达水平较模型组逐渐降低。这表明医用臭氧能显著改善膀胱炎大鼠膀胱组织的炎症状况，且浓度越高效果越好。在对氧化应激反应影响方面，模型组膀胱肌层组织SOD、GSH-PX活性较对照组降低，治疗组20、30 μg/mL时膀胱肌层组织SOD、GSH-PX活性较模型组升高。这提示膀胱炎大鼠膀胱组织存在抗氧化指标活性下降，而医用臭氧灌注能促进抗氧化指标活性的恢复。因此，医用臭氧可能通过阻断氧化应激反应使氧化与抗氧化水平重新实现动态平衡状态，有利于降低或避免炎症物质过度产生以发挥和扩大其抗炎效应，继而避免膀胱组织结构的损伤及其功能的失常。这进一步阐明了医用臭氧在膀胱炎治疗中的作用机制，为其推广使用提供了可靠的理论依据。

尽管医用臭氧具有可靠的治疗价值与良好的应用前景，但本结果还显示使用高浓度(30 μg/mL)医用臭氧7 d可诱发正常大鼠膀胱黏膜水肿、毛细血管扩张、组织内可见炎症现象等。这可能与臭氧具有强烈的氧化作用易使组织氧化受损有关，且组织受损程度与臭氧使用时间具有正相关性[24]；虽然该浓度与其他浓度相比无显著差异，但其所引起的膀胱黏膜受损等病理改变仍需引起足够重视，以免造成二次损伤。

综上所述，短时间内应用不同浓度医用臭氧对大鼠膀胱炎均有较好的杀菌效果，并能在一定程度上减轻尿频、尿急等症状，减轻炎症反应及氧化应激反应，尤以20、30 μg/mL时最为显著；但是，高浓度的医用臭氧使用仍需权衡利弊、慎重选取，方能取得利益最大化。