miR-369-3p在山荷叶素调控甲状腺癌细胞增殖、迁移中的作用

王雪，鲍敏丽，姚炳山

1 秦皇岛市中医医院药剂科，河北秦皇岛066000；2 秦皇岛市中医医院急诊科

甲状腺癌是临床常见的一种内分泌器官恶性肿瘤，我国甲状腺癌发病率逐年上升。由于甲状腺癌具有隐匿性，导致大部分患者失去最佳治疗时机[1-2]。研究表明，部分中草药具有抗甲状腺癌作用，但其具体作用机制尚未阐明[3-4]。山荷叶素是中药山荷叶提取物的主要成分，具有抗肿瘤作用。研究表明，山荷叶素可抑制卵巢上皮细胞癌细胞迁移及侵袭[5]，但山荷叶素与甲状腺癌的相关研究报道相对较少。微小RNA(miRNA)可通过靶向调控靶基因表达而调节细胞增殖及凋亡等生物学行为。研究表明，miR-369-3p在乳头状甲状腺癌中表达下调，上调其表达可抑制细胞迁移及侵袭[6]。但是，miR-369-3p是否可作为山荷叶素治疗甲状腺癌的潜在靶点尚未可知。2020年1月—12月，我们探讨了山荷叶素是否可通过靶向调控miR-369-3p表达而影响甲状腺癌细胞生物学行为。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 山荷叶素购自成都仪睿生物科技有限公司(纯度>98%)；人甲状腺癌细胞SW579购自美国ATCC；DMEM培养基、胎牛血清、CCK-8试剂、TRIzol试剂购自上海碧云天生物；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen；反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化；miR-NC、miR-369-3p mimic、anti-miR-NC、miR-369-3p Inhibitor购自广州锐博生物。

1.2 山荷叶素对甲状腺癌细胞增殖、迁移及miR-369-3p表达影响的观察

1.2.1 细胞分组与处理 SW579细胞接种于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素与100 μg/mL链霉素的DMEM培养基内培养，取对数生长期SW579细胞(2.5×105/mL)接种于6孔板，每孔200 μL；山荷叶素2.5 μmol/L组、5.0 μmol/L组、10.0 μmol/L组分别加入含2.5、5.0、10.0 μmol/L山荷叶素的DMEM培养基[7]培养24 h，将正常培养的SW579细胞为对照组，每组均设3个复孔。

1.2.2 细胞增殖情况观察 ①CCK-8实验：取各组SW579细胞(1×104/mL)接种于96孔板，每孔200 μL；每孔中加入CCK-8溶液10 μL，于培养箱内继续培养2 h；应用酶标仪检测各孔450 nm时的光密度值(OD)，并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(对照孔OD-实验孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)×100%。实验重复3次，取平均值。②平板克隆形成实验：收集各组SW579细胞接种于6孔板，每孔5×102个细胞；培养箱内培养14 d，弃培养基，预冷PBS洗涤；加入500 μL甲醇固定20 min，1%结晶紫染色液染色15 min，蒸馏水洗涤后晾干。于显微镜下观察对≥30个细胞的集落，计算细胞克隆形成数。实验重复3次，取平均值。

1.2.3 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。细胞铺板前用马克笔在24孔板的背面笔直地画出3条横线做标记。取各组SW579细胞(2×105/mL)接种于6孔板，每孔200 μL；待细胞长满时，采用20 μL枪头垂直于孔板背面的横线画出一条笔直的道痕，PBS洗涤划痕产生的细胞碎片。以此记时为0 h，拍照后将培养板放入培养箱内继续培养24 h取出拍照，根据划痕宽度变化计算划痕愈合率。划痕愈合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次，取平均值。

1.2.4 细胞中miR-369-3p表达检测 采用qRT-PCR法。采用TRIzol试剂分别提取各组SW579细胞总RNA，反转录合成cDNA。PCR扩增反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O补足体系至20 μL。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-369-3p相对表达量。miR-369-3p正向引物5′-CTCCTGGTACCTGAAGGGAGA-3′，反向引物5′-CTCCAAGGTGAGATTTGATACTGA-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.3 miR-369-3p对SW579增殖、迁移影响的观察 采用脂质体转染法将miR-NC、miR-369-3p mimic分别转染至SW579细胞，分别记为miR-NC组、miR-369-3p mimic组。按照“1.2.2”的方法观察细胞增殖情况，按照“1.2.3”的方法观察细胞迁移能力，按照“1.2.4”的方法检测细胞中的miR-369-3p。

1.4 抑制miR-369-3p对山荷叶素调控SW579增殖、迁移影响的观察 采用脂质体转染法将anti-miR-NC、miR-369-3p Inhibitor转染至SW579细胞，转染成功后加入含10.0 μmol/L山荷叶素的DMEM培养基培养24 h，分别记为山荷叶素+anti-miR-NC组、山荷叶素+miR-369-3p Inhibitor组。按照“1.2.2”的方法观察细胞增殖情况，按照“1.2.3”的方法观察细胞迁移能力，按照“1.2.4”的方法检测细胞中的miR-369-3p。

2 结果

2.1 山荷叶素对SW579增殖、迁移的影响 与对照组比较，山荷叶素2.5 μmol/L组、5.0 μmol/L组、10 μmol/L组细胞增殖抑制率均逐渐升高，细胞克隆形成数逐渐减少，划痕愈合率逐渐降低(P均<0.05)。见表1。

表1 荷叶素对SW579增殖、迁移的影响

2.2 山荷叶素对SW579中miR-369-3p表达的影响 与对照组(1.00±0.00)比较，山荷叶素2.5 μmol/L组、5.0 μmol/L组、10.0 μmol/L组miR-369-3p的表达量逐渐升高，分别为1.57±0.06、2.28±0.08、3.09±0.12(P均<0.05)。

2.3 miR-369-3p对SW579增殖、迁移的影响 与miR-NC组比较，miR-369-3p mimic组细胞中miR-369-3p表达增加，细胞增殖抑制率升高，细胞克隆形成数减少，划痕愈合率降低(P均<0.05)。见表2。

表2 miR-369-3p对SW579增殖、迁移的影响

2.4 抑制miR-369-3p对山荷叶素调控SW579增殖、迁移的影响 与山荷叶素+anti-miR-NC组比较，山荷叶素+miR-369-3p Inhibitor组中miR-369-3p表达减少，细胞增殖抑制率降低，细胞克隆形成数增多，划痕愈合率升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 抑制miR-369-3p对山荷叶素调控SW579增殖、迁移的影响

3 讨论

甲状腺癌发病机制较为复杂，癌基因活化或抑癌基因失活等均可能促进甲状腺癌的发生及发展。既往研究显示，部分中草药及其活性成分可通过调控多个基因或信号通路表达而发挥抗甲状腺癌作用[8-9]。miRNA在甲状腺癌中表达异常，并可影响甲状腺癌细胞生物学行为，还可能作为甲状腺癌靶向治疗的潜在靶点[10-11]。但是，miRNA是否可作为中草药治疗甲状腺癌的潜在靶点尚未完全阐明。

山荷叶也被称为窝儿七，是一种在秦巴地区民间广泛使用的草药，具有“破血生肌、解热镇痛消炎、刺激肠蠕动”的功效。现代药理研究表明，山荷叶包含木脂素类、黄酮类等活性成分，显现出良好的除疣、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、镇痛等活性，临床常用于治疗风湿性关节炎、腰腿疼痛、骨蒸潮热、跌打损伤、月经不调等[12]。山荷叶素是芳基萘类木脂素家族的天然化合物，具有促进血液循环、解毒消肿和改善糖脂代谢的作用，在结直肠腺癌细胞CaCo-2中显示出良好的抗病毒活性[13]。最近的研究发现，山荷叶素还具有抗肿瘤作用。例如：山荷叶可抑制食管癌细胞TE-1和ECA-109的增殖、迁移、肿瘤血管形成，并诱导S期细胞周期阻滞[14]；山荷叶素作为新型V-ATPase抑制剂，显著抑制人胃癌细胞SGC7901的增殖并诱导其凋亡[15]；山荷叶素对宫颈癌HeLa、肺癌A549和H460细胞也显示出细胞毒性[16]。但是，山荷叶素对甲状腺癌细胞生物学行为的影响尚未可知。本研究结果显示，随着山荷叶素浓度升高，甲状腺癌细胞增殖抑制率逐渐增高，克隆形成数逐渐减少，划痕愈合率逐渐降低。这表明山荷叶素可抑制甲状腺癌细胞增殖、克隆形成及迁移，提示与此前报告的抗肿瘤活性[14-15]类似。因此，山荷叶素有可能作为甲状腺癌的抑癌剂，但其具体作用机制尚不清楚

本研究进一步探究山荷叶素抗甲状腺癌的作用机制，结果随着山荷叶素浓度的升高，甲状腺癌细胞中miR-369-3p表达量逐渐升高，提示山荷叶素有可能通过促进miR-369-3p表达而发挥抗甲状腺癌作用。miR-369-3p表达失调已在许多疾病中被报道，包括癌症。例如：miR-369-3p在甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡癌组织中表达水平降低，其下调与甲状腺癌患者较低的生存率相关；上调miR-369-3p可抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖,机制与靶向下调其靶标TSPAN13有关[17]。miR-369-3p在肝细胞癌组织和细胞中呈低表达，上调其表达可抑制肝细胞癌细胞生长及转移，这种抗肝细胞癌的作用是通过抑制PAX6表达来实现的[18]。miR-369-3p在前列腺癌细胞中表达下调，上调其表达可抑制前列腺癌细胞增殖及迁移，其中CFL2被证实是miR-369-3p的下游靶基因[19]。这些研究表明，在肿瘤发生及发展过程中,miR-369-3p可能通过对抗肿瘤细胞的增殖、转移等特性而发挥抑癌基因的作用。本研究结果显示，miR-369-3p过表达可减弱甲状腺癌细胞增殖、克隆形成及迁移能力，与前述报告相吻合。此外，抑制miR-369-3p表达可拮抗山荷叶素对甲状腺癌细胞增殖、克隆形成及迁移的抑制作用，提示山荷叶素可能通过促进miR-369-3p表达而抑制甲状腺癌发展进程。根据上述报道，miR-369-3p实现抗癌功能与靶向不同的下游靶标(TSPAN13、PAX6、CFL2等)有关，推测本研究中miR-369-3p对甲状腺癌的作用也与这些靶标联系密切。

综上所述，山荷叶素可通过上调miR-369-3p表达抑制甲状腺癌细胞增殖、克隆形成及迁移，miR-369-3p可能作为山荷叶素治疗甲状腺癌的潜在靶点。但是，山荷叶素是否通过调控其他基因或信号通路表达发挥抗甲状腺癌作用尚需进一步探究。