甜橙SPL基因家族的鉴定及其在成花诱导中的表达分析

杨 杰，陈 蓉，胡文娟，吴巧玲，陈健美，李兴涛

(赣南师范大学 生命科学学院，国家脐橙工程技术研究中心，江西赣州 341000)

SQUAMOSA promoter binding protein-like(SPL)蛋白又被称为SQUAMOSA promoter binding protein(SBP)-box proteins，是广泛存在于绿色植物中的一类转录因子，在植物胚胎发育、叶片生长、成花转变、育性、赤霉素响应及胁迫应答等过程中起重要调控作用[1]。已发现的SPL/SBP家族成员都具有高度保守的SBP结构域，能识别并结合到SQUAMOSA(SQ-UA)启动子上[2]。该结构域由76个氨基酸残基组成，一般含2个锌指结构域，即Cys-Cys-His-Cys(C2HC)和Cys-Cys-Cys-His(C3H)，以及1个保守核定位信号[3]。此外，部分SPL基因的表达还会受到miR156/miR157的调控[4]。

SPL基因家族是多基因家族，参与植物生长发育和逆境胁迫等过程[5]。目前，桃[2]、拟南芥[6]、水稻[7]、番茄[8]和草莓[9]等植物的SPL基因已被陆续鉴定。其中，Chao等[5]发现AtSPL1和AtSPL12的过量表达会增强拟南芥的耐热性；过量表达AtSPL3和AtSPL9会使拟南芥提前开花[10]；AtSPL15在花诱导过程中通过激活花调节因子FRUITFULL(FUL)和 miR172b 来诱导拟南芥开花[11]；Wang等[12]发现AtSPL2可直接作用于ASYMMETRIC LEAVES2(AS2)来调控花器发育和植物育性；将水稻OsSPL16高表达，可提高其籽粒的质量和产量[13]。

甜橙(Citrussinensis)是柑橘中主要的鲜食品种，因其汁多味美、营养丰富受到消费者喜爱。但是中国甜橙品种单一，成熟期集中在11、12月份，造成鲜果集中上市，制约了鲜橙产业的持续稳定发展。‘赣南早’是国家脐橙工程技术研究中心选育的甜橙早花品种，是甜橙品种‘纽荷尔’的芽变系，果实熟期比‘纽荷尔’提前30 d以上[14]。本课题组经过多年观察发现，‘赣南早’比‘纽荷尔’提前10～15 d开花。研究发现，在果树栽培过程开花期提早，果实可提早成熟[15-16]。SPL基因家族在植物花发育过程起重要调控作用，但至今其在甜橙成花诱导过程中的作用机制尚未被报道。本研究鉴定了CsSPL基因家族，分析其蛋白理化性质、染色体定位、基因结构等及其在甜橙不同组织的表达，并通过qRT-PCR对比分析甜橙不同花期品种成花过程中CsSPLs的相对表达水平，为探讨CsSPLs在甜橙开花调控等方面的生物学功能提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

甜橙早花品种‘赣南早’和对照品种‘纽荷尔’来自赣南师范大学国家脐橙工程技术研究中心，均是枳橙为砧木的8年生果树。于2019年11月1日开始采集生长良好、长势一致的甜橙品种短枝新梢(方向朝南)的花芽和叶片进行对比试验，之后每隔30 d(5个成花时期)取样一次，每次取3棵。经液氮冷冻后置于-80 ℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 甜橙SPL基因鉴定甜橙基因组数据来自CPBD(http://citrus.hzau.edu.cn/)，SPL-family模型(PF03110)来自Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)。使用HMMER3.0软件搜索CsSPLs，通过CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/term)和InterPro(https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)验证序列保守结构域，去除SBP结构域不完整的基因，得到的CsSPLs按照其在染色体的位置依次进行命名。

1.2.2 甜橙SPL基因分析利用ExPASy在线工具ProtParam(http://web.expasy.org/compute_pi/)和ProtComp9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)分析CsSPLs的等电点、分子量及亚细胞定位；采用在线软件SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODLE(https://swissmodel.expasy.org/)分别预测分析CsSPLs的蛋白二级结构和三级结构；使用Map MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)在线绘制CsSPLs在染色体上的分布；使用GSDS v2.0(http://gsds.gao-lab.org/)绘制CsSPLs的基因结构图；利用MEME(http://meme-suite.org/)分析CsSPLs编码的蛋白保守基序，Motif数量设为10；在MEGA 6.0中使用邻接法对甜橙和拟南芥的SPL蛋白序列进行系统发育进化树的构建，bootstrapping为1 000；使用TBtools分析CsSPLs间的共线性；利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测CsSPLs启动子区的顺式作用元件；从CPBD下载甜橙不同组织的转录组数据，使用TBtools进行表达热图的绘制。

1.2.3 RNA提取和qRT-PCR检测根据CsSPLs基因序列设计qRT-PCR引物(表1)，以柑橘ACTB作为内参基因，引物为CsACTB-F/CsACTB-R。使用植物总RNA提取试剂盒(Simgen，中国杭州)提取样品总RNA，使用反转录试剂盒(Simgen，中国杭州)反转录合成cDNA。利用2×SYBR Green PCR Mix(Simgen，中国杭州)在Light-Cycler 480型实时荧光定量PCR仪(Roche，Basel，Switzerland)进行qRT-PCR操作，每个样品3次技术重复。反应体系10 μL，其中，cDNA和ddH2O各2 μL，上下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green PCR Mix 5 μL。PCR程序：95 ℃ 60 s；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s；40 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法计算CsSPLs的表达水平，使用DPS数据处理软件分析基因表达量间的差异显著性，SigmaPlot 14.0软件制图。

表1 甜橙SPL基因的qRT-PCR引物信息

2 结果与分析

2.1 甜橙SPL基因鉴定及理化性质分析

从甜橙基因组鉴定出15个CsSPLs，根据染色体位置依次命名为CsSPL1～CsSPL15(表2)。CsSPL蛋白的CDS长度为394～3 229 bp，其中CsSPL3蛋白最短，CsSPL15蛋白最长；氨基酸数量为130～1 075 aa；等电点为5.99～9.28，其中CsSPL2、CsSPL7、CsSPL12和CsSPL14的等电点均小于7，为酸性蛋白，CsSPL11等电点是7，为中性蛋白，其余CsSPL蛋白均为碱性蛋白；CsSPL蛋白的分子量差异较大，最大CsSPL15为118.75 kD，最小CsSPL3为14.73 kD。亚细胞定位预测的结果显示，仅CsSPL1、CsSPL6、CsSPL8和CsSPL9定位在细胞外，其余CsSPL蛋白均定位在细胞核。

表2 甜橙SPL蛋白理化性质

2.2 甜橙SPL蛋白的二级结构预测

甜橙SPL蛋白的二级结构预测结果表明(表3)，无规则卷曲是构成甜橙SPL蛋白二级结构的主要组成部分，所占比例在31.28%～72.03%之间，其次是α-螺旋和β-折叠，所占比例分别为11.11%～43.59%和5.56%～6.67%。

表3 甜橙SPL蛋白二级结构组成

2.3 甜橙SPL基因的染色体分布

15个CsSPLs不均匀地分布在甜橙6条染色体上(图1)。其中，chrUn上分布最多，为4个CsSPLs；chr1和chr7次之，各有3个CsSPLs；chr2和chr9各有2个CsSPLs；chr5上最少，仅有1个CsSPLs。

2.4 甜橙SPL基因的结构和保守基序

CsSPLs的基因结构相对复杂(图2)。内含子数为1～9个，其中CsSPL10、CsSPL11和CsSPL15的内含子数最多，为8～9个；CsSPL3、CsSPL4和CsSPL5内含子数最少，均为1个。外显子数为2～9个；CsSPLs被划分成8个亚族，同一亚族CsSPLs的基因结构较为相似，如CsSPL1、CsSPL8和CsSPL14同属S9亚族，均含3个长度相似的外显子，证明亲缘关系近的CsSPLs具有较保守的基因结构。

CsSPLs的蛋白序列含有10个保守性较强的Motif(图3)。除CsSPL5只含Motif 1和Motif 3外，其余CsSPLs均含有Motif 1、Motif 2和Motif 3。此外，CsSPL10、CsSPL12和CsSPL15还含有Motif 4～Motif 9；CsSPL2、CsSPL7、CsSPL9和CsSPL14都含有Motif 10。总体来看，同一亚族的CsSPLs具有相似的Motif分布。但是，个别亚族间不同的CsSPLs含有不同的Motif，如CsSPL3的Motif数量相比于同一亚族的其他基因有缺失，暗示同一亚族的CsSPLs有不同的调控功能。对10个Motif结构进行分析(表4)，发现Motif 4含有50个保守氨基酸，Motif 10保守氨基酸数最少，仅有11个。

表4 甜橙SPL蛋白保守序列

2.5 甜橙SPL基因的系统进化分析

构建拟南芥(17个)和甜橙(15个)SPL家族的系统进化树(图4)。结果显示，整个进化树被分为9个亚族(S1～S9)。除S2亚族之外，其余8个亚族均含CsSPLs。其中S3、S8和S9亚族均含3个CsSPLs，数量最多；其次是S6亚族，含2个CsSPLs；S1、S4、S5和S7亚族最少，各仅含1个CsSPLs。

2.6 甜橙SPL基因的共线性分析

为了确定甜橙SPL家族成员的复制事件，对甜橙基因组进行了共线性分析(图5，A)。结果显示，CsSPL6/CsSPL9和CsSPL8/CsSPL14存在共线性关系，分别位于chr5、chr7和chrUn上。为进一步阐明SPL基因在甜橙和双子叶模式植物拟南芥间的进化关系，对2个物种进行了共线性分析。如图5，B所示，在甜橙和拟南芥之间鉴定出CsSPL8/AtSPL13b、CsSPL11/AtSPL7、CsSPL14/AtSPL13a和CsSPL14/AtSPL13b共4个同源基因对，其中AtSPLs均位于拟南芥5号染色体上，CsSPLs分别位于chr7、chr9和chrUn上。此外，存在共线性关系的基因在进化分析中被划在同一亚族。揭示这些基因的起源进化中发生了串联重复，暗示它们的结构和功能存在相似性。

2.7 甜橙SPL基因的顺式作用元件预测

预测CsSPLs上游2 000 bp启动子序列上光响应元件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件的分布情况(图6)。其中，15个CsSPLs均存在光响应元件和激素响应元件，推测CsSPLs在甜橙响应光调控及体内激素平衡过程中发挥重要作用；除CsSPL2和CsSPL6外，其他13个CsSPLs均存在数量不一的逆境胁迫响应元件，揭示了CsSPLs在不同抗逆生境中起重要的调控作用。

2.8 甜橙SPL基因在其不同组织的表达分析

基于甜橙转录组数据分析CsSPLs在甜橙愈伤组织、花、叶片和果实中的表达情况，绘制CsSPLs的表达热图(图7)。结果表明，CsSPLs在甜橙不同组织中的表达量存在较大差异。其中CsSPL3、CsSPL11、CsSPL12和CsSPL15在甜橙愈伤组织中优势表达；CsSPL3、CsSPL7、CsSPL8、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15在甜橙花中高表达；CsSPL4、CsSPL7、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15在甜橙叶片中高表达；甜橙果实中高表达的基因包括CsSPL3、CsSPL10、CsSPL12和CsSPL15。

2.9 甜橙SPL基因的表达特异性分析

选择花和叶片中高表达基因CsSPL3、CsSPL4、CsSPL7、CsSPL8、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15，在甜橙早花品种‘赣南早’和对照品种‘纽荷尔’成花阶段进行相对表达量检测(图8)。结果显示，8个CsSPLs在两甜橙品种的花芽和叶片中均有表达。各时期CsSPLs在花芽和叶片中的相对表达量表现为早花品种‘赣南早’均高于对照品种‘纽荷尔’。其中，在4时期和5时期，CsSPLs在两甜橙品种的相对表达差异显著，‘赣南早’比‘纽荷尔’上调数倍。这些结果证明，CsSPLs在甜橙成花发育和开花时期等过程中发挥调控作用。

3 讨 论

SPL基因家族广泛存在于植物中，且基因成员数量不会随着基因组大小的变化而成比例变化[17]。本研究从甜橙基因组中鉴定得到15个CsSPLs，其数量较苹果(27个)少，与番茄(15个)一致，比野草莓(14个)多[3,9]。15个CsSPLs的内含子-外显子数量差异较大，40%的CsSPLs含有2个内含子和3个外显子，最多的CsSPL15的内-外显子数量均为9，而最少的CsSPL3仅含1个内含子和2个外显子。该结果与前人在苦荞[18]和小麦[19]中的研究结果相近。CsSPL12的基因结构不同于CsSPL10和CsSPL15，这可能是同一亚族不同基因在进化过程中出现了内含子的丢失或增加。此外，CsSPLs的氨基酸长度变化范围较大，这可能与CsSPLs的功能多样性有关。

Preston 等[20]根据进化关系将拟南芥SPL蛋白序列的进化树构建为8个亚族。本研究中甜橙和拟南芥SPL蛋白序列聚类为9个亚族，其中AtSPLs同样被划分在除S4亚族之外的8个亚族，而CsSPLs被划分在S1、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9亚族。CsSPL4和AtSPL3分别被划分在2个亚族，需进一步研究其功能的互补性。另外，CsSPLs的启动子区域包括大量与植物生长发育和逆境胁迫相关的顺式作用元件，刘婷婷等[21]也发现萝卜SPL基因家族成员启动子上存在激素、低温和干旱的响应元件，支持了本研究的分析结果。

目前已有许多研究证明SPL基因家族参与花的生长发育，在调控植物成花周期过程中发挥重要作用[22]。本研究分析了花和叶片中高表达CsSPLs在两甜橙品种中的表达模式，发现各时期CsSPL3、CsSPL4、CsSPL7、CsSPL8、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15均在早花品种‘赣南早’中优势表达；其中4和5时期，CsSPLs在两甜橙品种花芽和叶片中的相对表达差异显著增加。推测CsSPLs积极参与对甜橙开花周期的调控过程。本研究全面分析了甜橙SPL基因家族，发现CsSPLs响应甜橙花芽分化和开花过程，为解析CsSPLs调控开花周期的功能机制提供了基础资料，以便在后续研究中进一步验证。甜橙中参与成花的关键基因的挖掘为甜橙的早熟、鲜果非集中上市提供了新的途径。