黄芩清热除痹胶囊HPLC指纹图谱初步研究及3个成分含量测定

刘剑桥，刘晓闯，刘健，张艳艳，王团结，周安

黄芩清热除痹胶囊为安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，具有清热利湿、通络除痹之效，临床用于治疗湿热痹阻型类风湿关节炎[1]，疗效确切。本文通过对其进行指纹图谱[2]初步研究，并建立黄芩苷、黄芩素、栀子苷 3 个指标成分 HPLC 含量测定方法[3-4]，为其制剂工艺及质量控制研究提供参考[5]，提高制剂质量控制水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 Agilent 1260 高效液相色谱仪和Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）色谱柱购自美国 Agilent 公司；KQ-500DB 型数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；CP225D 型十万分之一电子天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.1.2 药品与试剂 黄芩清热除痹胶囊由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供；黄芩苷（批号：24512-63-8）、黄芩素（批号：491-67-8）和栀子苷（批号：21967-41-9）均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸、异丙醇均为色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制备

1.2.1.1 供试品溶液制备 取胶囊内容物约 0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 50% 甲醇 25 ml，超声处理 30 min，放冷，滤过。置 25 ml 量瓶中，加 50% 甲醇至刻度，摇匀，即得。

1.2.1.2 对照品溶液制备 精密称取栀子苷、黄芩苷、黄芩素适量，置于 5 ml 容量瓶中，分别用甲醇定容，得单一对照品溶液，浓度分别为 1.824、1.063、2.042 mg/ml。精密移取各单一对照品溶液 1 ml 于 10 ml 容量瓶中，甲醇定容，得混合对照品溶液。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈- 0.1% 甲酸水溶液；流速：1.00 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：1 μl；检测波长：238 nm。

采用梯度洗脱进行洗脱，梯度设置见表1。

2 结果

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1 指纹图谱及共有模式的建立 将 S1 ～ S12 共 12 个批次供试品溶液，进样检测，数据导入《中药色谱指纹图谱特征图谱相似度评价系统》（2012 版）分析，利用中位数法，时间窗为 0.1 min，生成 12 个批次黄芩清热除痹胶囊下的指纹图谱共有模式（图1）。

图1 12 批次黄芩清热除痹胶囊共有模式下的指纹图谱及对照谱图（R：对照谱）

2.1.2 共有峰的指认 将黄芩清热除痹胶囊提取物色谱图与对照品色谱图比对，指认出 3 个对应色谱峰，分别为栀子苷、黄芩苷、黄芩素（图2）。

图2 黄芩清热除痹胶囊提取物及对照品色谱图（1：栀子苷；2：黄芩苷；3：黄芩素；A：供试品溶液；B：混合对照品溶液）

2.1.3 指纹图谱相似度分析 使用《中药色谱指纹图谱特征图谱相似度评价系统》（2012 版），将各批次样品色谱图与对照谱图相比对，计算相似度。12 批次的指纹图谱与对照谱之间的相似度分别为 0.999、0.999、0.991、0.999、0.998、0.962、0.998、0.998、0.996、0.999、0.999、0.995，相似度均在 0.9 以上，说明本次研究中的 12 批次黄芩清热胶囊与对照谱之间相似度良好，质量稳定。

2.2 含量测定

2.2.1 系统适应性试验 取混合对照品溶液、供试品溶液各适量，进样检测。供试品色谱图和混合对照品色谱图在相同保留时间处有相应色谱峰且待测成分峰形良好、分离度均大于 1.5，理论板数以栀子苷、黄芩苷、黄芩素峰计均大于3000。

2.2.2 方法学考察

⑴对照品标准曲线：Y黄芩苷= 1096.8X + 8.2582，r= 0.9994，Y黄芩素= 1575.4X - 0.7328，r= 0.9997，Y栀子苷= 1410.2X +1.0977，r= 0.9996。 3 种物质分别在 0.3796 ～ 0.7593、0.0438 ～ 0.7875、0.0557 ～ 1.0029 μg 范围内线性关系良好，符合定量检测要求。

⑵定量限与检测限：栀子苷、黄芩苷、黄芩素的检测限分别为 1.570、0.308、2.042 μg/ml；定量限分别为 6.270、1.540、18.677 μg/ml。

⑶精密度：栀子苷、黄芩苷、黄芩素峰面积 RSD 分别为 1.29%、2.50%、0.67%（n = 5），仪器精密度良好。

⑷稳定性：栀子苷、黄芩苷、黄芩素峰面积 RSD 分别为 1.85%、1.70%、1.11%（n = 5），供试品溶液在 24 h 内有着良好的稳定性。

⑸重复性：栀子苷、黄芩苷、黄芩素峰面积 RSD 分别为 2.71%、1.51%、1.15%（n = 5），方法重复性好。

⑹加样回收率：栀子苷、黄芩苷、黄芩素平均回收率分别为 97.7%、99.5%、101.9%，RSD 分别为 1.21%、2.39%、2.34%（n = 5）。

2.2.3 样品含量测定 精密称取 12 批次的黄芩清热除痹胶囊，按照“1.2.1.1”项下方法，制成供试品溶液，测定样品中的栀子苷、黄芩苷、黄芩素 3 种成分含量，结果见表2。

表2 12 批次黄芩清热除痹胶囊提取物中3 种成分含量（%）

3 讨论

本研究建立了 12 批次黄芩清热除痹胶囊的 HPLC 指纹图谱，相似度分析符合要求，同时测定了 3 种指标成分黄芩苷、黄芩素、栀子苷的含量，为其制剂工艺研究及质量控制提供科学依据。

由于黄芩清热除痹胶囊的现行提取工艺为传统水提工艺，而组方中药所含多种活性成分为脂溶性成分。如黄芩苷、黄芩素、苦杏仁苷及薏苡仁油等成分水溶性差，是其色谱指纹图谱色谱峰信息不丰富的主要原因，在下一步研究工作中，拟结合指纹图谱研究、药效学实验对其提取溶媒及工艺进行优化。