上海市11种常规粳稻抗稻瘟病基因分子标记检测

谢水锋　宗士鹏　余飞宇　赵国超　李建粤

摘  要： 利用分子标记检测技术，对9种参加2020年上海市水稻区域试验的品种和2种本课题组新培育的新品系的共10个抗稻瘟病基因位点进行了检测. 结果显示，，， 3个基因在11种水稻中出现的频率达100%，，，，，和抗性基因在11种水稻中出现的频率分别为18.18%，9.09%，36.36%，90.90%，9.09%和81.81%. 此外，11种水稻中都没有检测到抗性基因. 研究结果为聚合更多抗稻瘟病基因，培育广谱抗稻瘟病水稻新品种提供了一定的科学依据.

关键词： 水稻（）; 抗稻瘟病基因; 分子标记

中图分类号： S 511    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2022）01-0056-08

Molecular marker detection of rice blast resistance genes in 11 Shanghai conventional varieties

In this study， by using these known molecular markers together with PCR technology， 10 rice blast resistance gene loci were amplified in 9 new rice varieties that were involved in 2020 Shanghai Regional Trial and 2 rice lines that were developed in our laboratory. Our results indicated that the occurrence frequency of， ， and genes was 100%， while the distribution frequency of ， ， ， ， ， and genes in 11 tested rice varieties/lines was 18.18%， 9.09%， 36.36%， 90.9%， 9.09%， 81.81%， and 0， respectively. Collectively， the results of this study provided scientific evidence for pyramiding more blast resistant genes and breeding new rice varieties with broad-spectrum rice blast resistance.

rice （）; blast resistance genes; molecular marker

稻瘟病是水稻的三大主要病害之一，嚴重影响稻米产量和品质.目前防治稻瘟病的方法主要可分为依赖于农药的化学防治和种植稻瘟病抗性品种两种.相比于化学防治，种植抗病品种防治稻瘟病不仅能够降低水稻种植成本，还能够缓解由于大量使用农药导致的环境污染以及农药残留问题.稻瘟病病菌具有极强的变异性，单个抗稻瘟病基因的水稻品种的抗病性呈现逐年减弱的趋势，因此，培育高效抗稻瘟病水稻新品种需要聚集多个抗病优良基因，以及具有广谱抗性的基因.

传统稻瘟病抗性接种鉴定方法不仅工作量大，费事费力，还容易受到病原菌毒力和天气条件等因素的限制，选择误差较大，效率低下.分子标记辅助选择技术是直接选择抗病基因，效率高，不受天气环境的影响，有利于抗性基因的快速聚合.

目前，已有100多个抗稻瘟病基因被报道，其中30多个基因已被克隆.随着对稻瘟病抗性基因的深入研究，已开发出大量抗稻瘟病基因的分子标记，这些分子标记可被用于将多个优良抗稻瘟病基因聚集到一个水稻基因组的研究中，有利于培育广谱抗病水稻新品种.MIAH等利用分子标记辅助选择将，，导入“MR129”水稻，获得高效的抗稻瘟病改良品种.SINGH等利用分子标记辅助选择和逐步回交的方法，将和导入到恢复系“PRR78”中，获得含有，抗稻瘟病基因的新恢复系.本研究分析了10个抗稻瘟病基因在11种水稻中的分布情况，为今后利用分子标记辅助选择技术培育聚合多种抗病基因的水稻新品种提供了分子依据.

1  材料与方法

试验材料

本试验收集了11个水稻材料进行稻瘟病抗性基因分析，其中9个是参加2020年上海市水稻区域试验的新品种：“武香粳968”“嘉87”“贤城美谷2号”“沪稻16-89”“浙禾香2号”“青香软20”“光明粳6号”“沪香粳201”和“沪软1212”;2个是本课题组新培育的优质水稻品系：“上师大21号”和“上师大22号”. 在基因检测中使用的对照材料“中植抗2号”由中科院分子植物科学卓越创新中心何祖华研究员的课题组提供.

试验方法

1.2.1 引物设计

参考前人报道，合成了能够检测10个抗稻瘟病基因位点的特异性引物（表1）.引物由北京擎科生物科技有限公司合成.

1.2.2 分子标记检测抗稻瘟病基因

采用CTAB法提取水稻叶片总DNA.

PCR擴增的反应体系共20 μL，10 μL PCR Mix，每种引物各0.4 μL（2 mmol∙L），水稻基因组DNA提取液1 μL，用ddHO补足至20 μL.不同的抗稻瘟病基因聚合酶链式反应（PCR）反应程序，除了退火温度和延伸时间不相同外（表1），其他PCR反应程序均为：98 ℃预变性3 min;98 ℃变性10 s，退火时间30 s，延伸温度72 ℃，共30个循环;72 ℃再次延伸5 min，最后12 ℃放置5 min.

PCR产物采用质量浓度为0.03 g∙mL的琼脂糖凝胶进行电泳检测，核酸染液染色，利用紫外凝胶成像仪拍照记录检测结果.

2  结果与分析

基因检测

抗稻瘟病基因存在于第6染色体上，是的等位基因.用Pi2-F/Pi2-R引物对供试材料抗稻瘟病基因进行检测，PCR产物中存在450 bp片段的为抗病品种/系，PCR产物中存在282 bp片段的为感病品种/系.在受测的11个品种/系中，只有“浙禾香2号”和“上师大21号”扩出450 bp的目的片段（图1（a））.结果表明“浙禾香2号”和“上师大21号”含有抗性基因.

基因检测

抗稻瘟病基因存在于第9染色体上.利用Pi5-F/Pi5-R引物对供试材料基因进行检测，PCR产物中存在206 bp片段的为抗病品种/系，存在307 bp片段的为感病品种/系.在11个样品中（图1（b）），只有“沪稻16-89”的PCR产物扩增出了206 bp条带，表明该品种含有抗性基因.

基因检测

位于第6染色体上的抗稻瘟病基因Pi9，是抗稻瘟病主效基因之一.利用Pi9-F/Pi9-R引物对试验材料中抗稻瘟病基因进行检测，PCR产物中含有291 bp特异性片段的为抗病品种/系，含397 bp特异性条带的为感病品种/系.PCR检测结果（图1（c））发现：11个供试水稻中，4个品种/系包括“贤城美谷2号”“沪稻16-89”“青香软20”和“沪软1212”能扩出291 bp条带，含有抗病基因.

基因检测

抗稻瘟病基因存在第6染色体上，对多数的稻瘟病生理小种表现出广谱抗性.采用“中植抗2号”作为对照，利用M80410-F/M80410-R引物对供试样品进行检测.PCR产物含有517 bp片段的为抗病品种/系，无扩增条带的为感病品种/系.PCR检测结果（图1（d））发现：11种供试水稻中均无扩增条带，表明它们均不含抗病基因.

基因检测

抗稻瘟病基因位于第11染色体上，由-和-组成.利用Pikm1-F/Pikm1-R和Pikm2-F/Pikm2-R引物分别对Pikm1和Pikm2位点进行检测.检测出174 bp条带的为Pikm1抗病品种/系，检测出290 bp条带的为Pikm2抗病品种/系.若同时检测到这2个条带该品种/系含有完整的抗性基因.从图1（e）和1（f） 检测结果可以看出，11个受试水稻中，“武香粳968”“浙禾香2号”“青香软20”“光明粳6号”和“上师大21号”均含有Pikm1抗性位点，均能扩增出174 bp条带.而“嘉87”“青香软20”和“上师大21号”均扩增出了290 bp条带，均含有Pikm2抗性位点.11个受试水稻中，只有“上师大21号”同时含有Pikm1抗性位点和Pikm2抗性位点，因此，“上师大21号”含有完整的抗性基因.

基因检测

利用Pi36-F/Pi36-R引物进行PCR扩增检测，PCR产物有628 bp目的条带的为含抗病基因的品种/系，无扩增条带的为不含有抗病基因的品种/系.在11种受试水稻中（图1（g）），“武香粳968”“嘉87”“沪稻16-89”“浙禾香2号”“青香软20”“光明粳6号”“沪香粳201”“沪软1212”“上师大21号”和“上师大22号”都扩增出628 bp，它们都含有基因.只有“贤城美谷2号”无扩增产物，不含有基因.

基因检测

经Pi37-F/Pi37-R引物检测，具有抗稻瘟病基因的品种/系的，PCR条带中含有716 bp条带，而不含有抗性基因品种/系的PCR产物则无扩增条带. 11种受试水稻的PCR检测结果（图1（h））表明，11种水稻均含抗稻瘟病基因.

基因檢测

利用Pi41-F/Pi41-R引物对供试样品抗稻瘟病基因进行检测，具有抗病基因的水稻PCR条带中含有176 bp特异性条带，不含有抗病基因的水稻则无扩增条带.PCR检测结果（图1（i））显示，11种水稻均含有抗性基因.

基因检测

经Pid2-F/Pid2-R引物检测，具有抗稻瘟病基因-的PCR条带中含有779 bp条带.不含有-抗病基因水稻的PCR产物则无扩增条带.经检测（图1（j））发现，11种水稻均含-抗稻瘟病基因.

基因检测

位于第2染色体上，对水稻的穗颈瘟有一定的抗性.根据LIU等设计的一套检测抗病等位基因的显性标记Pibdom和感病Pib等位基因的显性标记Lys145，对供试材料的基因进行检测.抗病显性分子标记Pibdom能够扩增出365 bp的特异性条带，感病显性分子标记Lys145能够扩增出803 bp的特异性条带.检测结果如图1（k）和1（l）所示，“武香粳968”“嘉87”“沪稻16-89”“浙禾香2号”“青香软20”“光明粳6号”“沪香粳201”“上师大21号”和“上师大22号”扩增出了365 bp，含有抗病基因.而“贤城美谷2号”和“沪软1212”扩增出了803 bp，不含抗病基因.

种水稻个抗稻瘟病基因的分布情况

尽管11种水稻都含有多个抗稻瘟病基因，但是每种水稻的抗性基因数量不相同.检测发现“沪稻16-89”和“上师大21号”含有7个抗稻瘟病基因，而“贤城美谷2号”含有抗病基因数量最少，只有4个，其他的水稻品种大多数都含有5～6个基因（表2）.

本次研究发现，9个参加2020年上海市水稻区域试验的新品种以及本课题组新培育的2个优质水稻品系都含有，和-抗性基因.和出现的次数都只有1次，出现频率为9.09%;因为在11个样品中都没有检测到抗性基因，的出现频率为0（图2）.

3  讨 论

本研究利用10个抗稻瘟病基因分子标记对9个参加2020年上海市区域试验和2个本课题组培育的新品系进行检测，分析了11种水稻稻瘟病抗性基因的分布情况.结果显示，11种水稻均含，和这3个抗性基因，其他7个抗性基因（，，，，，和）在11种水稻中的分布各不相同（表2），其中，和在11种水稻中出现的频率较低，在11种水稻中出现的频率为0，说明这4个抗性基因在上海市抗稻瘟病水稻育种中具有巨大的开发潜力.2017年HAN等报道发现上海22种常规粳稻都含有抗病基因;ZHAI等在12种浙江省常规晚粳稻品种也都检测到抗病基因.本研究发现：在11种被检测水稻中有9种水稻都含有抗病基因，表明抗病基因在粳稻中具有很大分布几率，但也不是所有粳稻品种都含有抗病基因.

LI等發现，含有的水稻对6个强致病性小种均表现出较好的抗性，但是只含有单个基因的水稻抗病性较差.因此，与其他主效基因聚在一起时，水稻才能表现较强的稻瘟病抗性.HUANG等对重庆地区73个水稻骨干亲本稻瘟病抗性进行研究发现，含有3～4个抗稻瘟病基因的水稻亲本的抗病率均为100%，也说明了抗稻瘟病基因聚合可以提高水稻的稻瘟病抗性.WU等的研究结果显示：含抗性基因数量多的水稻，对稻瘟病菌有较好的抗性效应.此外，ZHANG等研究发现，水稻中抗稻瘟病基因数量和稻瘟病抗性有一定的关系，随着抗性基因数量的增加，水稻的稻瘟病抗性也不断提高.因此培育抗稻瘟病水稻需要聚集多种主效抗病基因来形成稻瘟病的广谱抗性，但基因聚合不是简单地将抗性基因叠加起来，需要考虑抗性基因之间的关系，例如，，，和-互为复等位基因，同时也需要和田间性状相结合，选择既抗性强又有很好农艺性状的水稻进行育种，从而培育出优质的抗稻瘟病水稻.

本研究结果表明，9个参加2020年上海市水稻区域试验的品种和2个本课题组培育的新品系都具有较多抗稻瘟病基因，但是这些水稻实际的稻瘟病抗性还需进一步田间试验进行验证. 本研究结果为上海市利用分子标记辅助选择培育广谱、持久的抗稻瘟病水稻研究提供了参考.

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（责任编辑：顾浩然，包震宇）

收稿日期： 2021-12-02

基金项目： 上海市科委现代农业科技创新项目（19391900500）

作者简介： 谢水锋（1995—），男，硕士研究生，主要从事植物分子遗传学方面的研究. E-mail： 1000496741@smail.shnu.edu.cn

* 通信作者： 赵国超（1983—），男，副教授，主要从事植物分子遗传学方面的研究. E-mail： zgc1983@shnu.edu.cn;

李建粤（1958—），女，教授，主要从事植物分子遗传学方面的研究. E-mail： lijianyue01@shnu.edu.cn

引用格式： 謝水锋， 宗士鹏， 余飞宇， 等. 上海市11种常规粳稻抗稻瘟病基因分子标记检测 [J]. 上海师范大学学报（自然科学版），2022，51（1）：56‒63.

 XIE S F， ZONG S P， YU F Y， et al. Molecular marker detection of rice blast resistance genes in 11 Shanghai conventional  varieties [J]. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2022，51（1）：56‒63.