小叶中国蕨中一种ent-贝壳杉烷型二萜化合物分离与结构表征

汤丽萍　姜天菊　戴锡玲　张欣　姜灿　王妮娜　黄国正　曹建国

摘  要： 采用硅胶柱色谱法和重结晶法分离小叶中国蕨（）乙酸乙酯相粗组分.从该植物中分离出一种化合物（-kaurane-2β，16，18-triol），并通过1D和2D核磁共振谱、高分辨率质谱和单晶X射线衍射方法表征了该化合物的结构. 这是从小叶中国蕨中首次分离出来的一种新颖的-贝壳杉烷型二萜化合物.

关键词： -贝壳杉烷二萜化合物; 小叶中国蕨（）; 单晶X射线

中图分类号：  R 284.1    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2022）01-0032-07

Separation and structural characterization of an -kaurane diterpenoid from

TANG Liping， JIANG Tianju， DAI Xiling， ZHANG Xin， JIANG Can，WANG Nina， HUANG Guozheng， CAO Jianguo

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China; 2.School of Chemistry andChemical Engineering， Anhui University of Technology， Ma’anshan 243002， Anhui， China）

In this study， the crude fraction of ethyl acetate phase of was separated by silica gel column chromatography and recrystallization method. The results showed that a compound， i.e.， kaurane2β， 16α， 18α-triol was isolated from the plant and established by means of 1D and 2D NMR， MS， and single-crystal Xray methods. It is a novel kaurane diterpene that was isolated from for the first time.

kaurane diterpene; ; single-crystal X-ray

0  引 言

粉背蕨屬（）原属于中国蕨科（Sinopteridaceae），按照最新的蕨类植物分类系统（PPG），它们被归类于凤尾蕨科（Pteridaceae）.该属植物常旱生，植株矮小，孢子囊群着生于叶片边缘.粉背蕨属的许多种类的叶片下表面有淡黄、白或硫磺色的粉状物.本属植物中一些种类具有药用价值，在中国民间作为草药使用，如银粉背蕨（）在畲族、蒙古族等少数民族中被用来治疗月经不调、腹痛、结核病和出血等.

小叶中国蕨（）是中国特有的一种蕨类植物，仅分布于中国西南及华北少部分地区，生长于海拔500～3 200 m的林下及灌丛石灰岩缝、钙质石缝中.尽管还没有关于小叶中国蕨的药用记录，但因其与银粉背蕨在形态上极为相似，药材商在收购药材时，常把小叶中国蕨当作银粉背蕨一并收购，造成市售药材的混用和误用.目前，对小叶中国蕨的研究大多集中在形态和分布上，对其化学成分的研究尚未深入.考虑到这两种植物可能有不同的次生代谢产物，因而具有不同的药用功效，因此本课题组研究了其化学成分，从小叶中国蕨中分离到了2种新型二萜，以及部分已知萜类和黄酮类化合物，这与银粉背蕨次生代谢产物有一定的差异.此后，又从该植物全株中首次分离出一种新颖的-贝壳杉烷型二萜，通过1D和2D核磁共振（NMR）谱、高分辨率质谱（HRMS）和单晶X射线衍射法对该化合物进行了结构上的表征，并确认该化合物为-kaurane-2β，16α，18α-triol.本研究进一步丰富了小叶中国蕨天然产物种类，对开发和利用小叶中国蕨具有一定的价值.

1  材料与方法

实验材料

实验用小叶中国蕨购自云南省，样品经上海师范大学曹建国教授鉴定为小叶中国蕨.凭证标本（XY20180601）保存于上海师范大学奉贤校区植物园植物化学实验室.干燥全草经筛选后剪段，粉碎机粉碎备用.

实验试剂：石油醚（PE，分析纯）、乙醇（EtOH，分析纯）、乙酸乙酯（EtOAc，分析纯）、二氯甲烷（CHCl，分析纯）、甲醇（MeOH，分析纯），上海润捷化学有限公司;硅胶（G60F-254），青岛海洋化工股份有限公司;Sephadex LH-20凝胶（分析纯），上海润捷化学有限公司;薄层层析硅胶板，烟台江友硅胶开发有限公司.

仪器设备：落地式连续粉碎机（DFY-500），上海鼎广仪器有限公司;循环水式多用真空泵（SHZ-D（Ⅲ）），上海科升仪器有限公司;旋转蒸发仪（N-1100），日本EYELA;低温冷却水循环泵（CCA-20），巩义市予华仪器有限责任公司;电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A），上海海向仪器设备厂;纯水仪（Master-S30），上海和泰仪器有限公司;紫外分析仪（ZF-1），上海骥辉科学分析仪器有限公司;电子天平（FA1204B），上海天美天平仪器有限公司.

核磁共振谱使用Bruker 600 MHz光谱仪（Bruker，瑞士）测定.晶体结构采用Bruker D8 Venture衍射仪石墨单色仪CuKα辐射（=0.154 178 nm）测定.熔点采用X-4微熔点仪（上海仪电物理光学仪器有限公司）测定.采用AB SCIEX Elite四极杆飞行时间质谱仪获得高分辨率质谱（电喷雾正模式，ESI）.

实验方法

1.2.1 小叶中国蕨粗提物提取与分离

小叶中国蕨干燥全草8.8 kg，粉碎后用90%（体积分数）EtOH约100 L，分4次室温回旋提取，回收溶剂得总浸膏（450 g），加水使之悬浮，依次使用PE、EtOAc、CHCl、正丁醇（n-BuOH）各萃取3次，得四部分粗提物，质量分别为110，90，5，30 g.

1.2.2 -贝壳杉烷二萜化合物提取与分离

乙酸乙酯相浸膏经过200～300目（45～75 µm）硅胶柱层析分离，洗脱剂梯度为（PE）∶（EtOAc）=1∶2～0∶1，得到49个组分.第30组分再使用中压制备色谱以（CHCl）∶（MeOH）=1∶0～0∶1梯度洗脱后共获得了48个亚组分，随后第35～42亚组分试管壁上有颗粒状固体析出，合并后利用丙酮洗剂，得到80 mg的淡黄色粉末.

1.2.3 目标化合物纯化与单晶培养

上述淡黄色粉末经薄层色谱和核磁共振谱分析显示还存在少量的杂质.随后取30 mg该粉末，利用硅胶柱色谱，以体积比（CHCl）∶（MeOH）=10∶1对其进行反复洗脱，得到8.2 mg的白色粉末，即纯的化合物.取少量纯品，加热溶解于少量的CHCl/MeOH混合溶剂，然后静置于室内避光处，待溶剂缓慢挥发，析出少量的无色针状晶体.

2  结果与分析

解谱分析过程

化合物为白色粉末，析出无色针状晶体;难溶于二氯甲烷、氯仿，可溶于二甲基亚砜（DMSO）、MeOH;254 nm下无荧光，显色剂为香草醛-硫酸烤硅胶板，呈紫色点.根据HR-ESI-MS（ 322.248 3[M+H]，calcd 323.248 1）和C NMR数据显示其分子式为CHO. 3 500～2 700 cm的红外吸收带表明存在3个羟基.H，C NMR和Dept光谱显示存在3个甲基，分别为1.57（s，H-17），1.31（s，H-19）和 1.16 （s，H-20），9个亚甲基[包括一个含氧碳（ 65.3，C-18）]，4个次甲基[包括一个含氧碳（ 64.1，C-2）]和4个季碳.

H NMR谱表明， 1.16～1.57被确定为典型甲基信号，并且根据异核单量子相关（HSQC）譜（图1）中的相关性来分配H-17（ 1.57）/C-17（ 25.5），H-19（ 1.31）/C-19（ 28.8）和H-20（ 1.16）/C-20（ 20.2）3个甲基的位置.首先通过H-17的异核多量子相关（HMBC）（图2）可确定H-17的3个C关联信号分别为 49.7，59.0和78.1，由于季碳处于C谱最低场，推出C-16（ 78.1），再根据HSQC谱可观察到 49.7对应一个H信号， 59.0对应2个H信号，则可以推出次甲基C-13（ 49.7）和亚甲基C-15（ 59.0），最后根据HSQC谱，推出H-13[ 2.17（1H，m）]和H-15[ 1.69～1.64（1H，m），1.96（1H，t，=11.7 Hz）].结合HMBC，由H-15的 1.64～1.69可看出一个未知C4信号为 45.8.同理，由 1.96可观察到另一个C信号为_C 57.7.继续通过两个C信号各自对应的HSQC谱，可推出一个为次甲基，一个为季碳，并结合H-15远程相关C信号可推断出次甲基C-9（ 57.7）、季碳C-8（ 45.8）和亚甲基C-7（ 43.4）.根据HSQC确定了H-9[ 1.14～1.05（1H）]和H-7[ 1.56～1.40（1H，m），1.72（1H，dd，=11.5，8.1 Hz）]，随后通过H-5的HMBC相关性归属了C-6（ 21.2），由HSQC确定H-6[1.56～1.40（1H，m），1.72（1H，dd，=11.5，8.1 Hz）].同样，根据甲基H-20的HMBC相关性可判断出季碳C-10（ 41.5）、次甲基C-5（ 57.0）和亚甲基C-1（ 51.1），以及较远亚甲基信号C-11（ 19.0）.随后结合HSQC相关性确定了H-5[ 1.14～1.05（1H）]，H-1[ 1.14～1.05（1H），2.56（1H，d，=11.7 Hz）]和H-11[ 1.64～1.59（1H，m），1.69～1.64（1H，m）].结合低场C-9（ 1.14～1.05; 57.7）的HMBC相关性，可以判断出C-12（ 27.6）/H-12[ 1.64～1.59（2H，m）].根据含氧碳次甲基C-2（ 64.1）的HSQC相关性可确定H-2[ 4.41（1H，tt，=11.3，4.2 Hz）]，再根据H-2的HMBC相关性可归类亚甲基C-3（ 46.6）和最后一个季碳C-4（ 41.5），随之H-3[ 1.37（1H，t，=12.1 Hz），2.92（1H，d，=12.7 Hz）]也被确定.同理，最后一个亚甲基C-14也得到归属，即为H-14[ 1.96（1H，dd，=11.2，4.5 Hz），2.05（1H，dd，=11.2，4.5 Hz）].

结合1D NMR和2D NMR谱相关数据的分析，化合物中的-贝壳杉烷型二萜骨架的归属也得到相应的验证.此外，从CHCl中获得了适合X射线晶体学分析的无色针状晶体，该化合物详细单晶数据存放于剑桥晶体学数据中心，编号20210750（图3），并确定了完整的结构和绝对构型（2，4，5，8，9，10，13，16）.化合物被确定为（2，4，4，6，8，9，11，11）-4-（hydroxymethyl）-4，8，11b-trimethyltetradecahydro-6a，9-methanocyclohepta[]naphthalene-2，8-diol，即-kaurane-2β，16α，18α-triol（图4）.通过无畸变极化转移增强（DEPT），化学位移相关（COSY），HSQC和HMBC谱确定H和¹³C NMR信号分配，如表1所示.

单晶衍射分析

单晶X射线衍射分析结果证实了化合物的分子结构.该化合物属于三斜晶系，结晶位于空间群，并且每个晶格中仅包含一个晶体学独立的有机物分子.如图3所示，在化合物的分子结构中，3个环己基和1个环戊基通过肩并肩的形式连接，形成其骨架结构.其中，所有的环己基均采用较为稳定的椅式构型.此外，在化合物的晶体结构中，两种不同的分子间C―H…O氢键弱作用（C―H…O：距离为2.80×10 m，角度为125.03°;C―H…O：距离为3.04×10 m，角度为154.98°）使其二维结构呈网格状.并进一步堆积成三维孔道结构，而且在孔道中包裹着大量的水分子.

3  讨 论

通过分离技术及谱图分析，从小叶中国蕨全草乙酸乙酯相粗提物中首次分离得到了一个不常见的二萜三醇化合物.通过文献对比，发现化合物的结构与-2α，16-18-trihydroxy-kauran结构相似，区别在于该化合物18号位甲氧基碳信号为S型，并且也和-kaur-16（17）-en-2β，6β，19-triol骨架相似，区别为该化合物在6号位无羟基、16号位是甲基和羟基结构，这些相似化合物的信息为化合物的结构确定及核磁共振谱归属提供了重要的帮助，但仍无法確定化合物的明确结构.后将该化合物白色粉末在CHCl/MeOH的混合溶剂中培养成无色针状晶体，并通过单晶X射线数据确定了其绝对构型，即为-kaurane-2β，16α，18α-triol.该结构与YAN等分离出的2β，16α，19-trihydroxy--kaurane是一致的.但是本研究的H，C NMR数据与其他报道的还有部分的差异，这可能是由于测量核磁共振谱时所用的氘代溶剂不同所引起的.另外，他们可能错误地把18位的羟基归到19位上.

通过本课题组对小叶中国蕨植物的研究，共获得了不同类型的二萜化合物，如鸟巢烷型二萜（即金粉蕨醇B和14-oxy-7，20-dihydroxycyath-12，18-diene）、-海松烷型二萜（-8（14），15-pimaradiene-2β，19-diol）和-贝壳杉烷型二萜（-kaurane-2β，16α，18α-triol和aleuritopsis B）等.其中金粉蕨醇B、aleuritopsis B和-8（14），15-pimaradiene-2β，19-diol这3个二萜类化合物质量较大，可能为小叶中国蕨中的特征性二萜化合物.而银粉背蕨中分离得到的二萜主要为半日花烷型二萜（粉背蕨酸）和-贝壳杉烷型二萜，即aleuritopsis A和aleuritopsis B.这表明小叶中国蕨与银粉背蕨化学成分存在不同，故不能混用.同时，本文作者正进一步开展了这些二萜化合物相关活性实验，并对结构特征与活性效果的关系做了进一步阐述.

蕨类植物又被称为羊齿植物，在植物系统中介于苔藓植物和种子植物之间.作为植物界的重要组成部分，蕨类植物不仅有食用、观赏、指示植物和修复环境等作用，在民间也常作药用.药用蕨类植物大多数以全草或根茎入药，且大多都含有黄酮类、萜类、酚酸、甾体和生物碱等活性成分.如槲蕨属（）的许多植物常被称为“骨碎补”被广泛使用，其有效成分具有强筋健骨、降血脂、镇痛等作用.因此，对药用蕨类植物的研究具有意义重大.

前人研究發现，银粉背蕨中主要天然产物为半日花烷型二萜和-贝壳杉烷型二萜类化合物.CHI等归纳总结了穿心莲植物中的有效成分半日花烷型二萜内酯化合物具有显著的抗炎、抗肿瘤和抗血栓等多种药理活性.ZHANG等详细阐述了近年来新发现与合成的-贝壳杉烷型二萜化合物的细胞毒活性作用，可以看出该类化合物在抗肿瘤活性方面已呈现出相当的潜力，这也佐证了粉背蕨属大多数植物可以入药.

4  结 论

小叶中国蕨是我国特有的一种粉背蕨属蕨类植物，目前，对其化学成分的研究尚未深入.本课题组系统地分离了小叶中国蕨全株植物，并在本研究中分离得到了一种-贝壳杉烷型二萜化合物.通过单晶X射线方法确定了其绝对构型，明确其为-kaurane-2β，16α，18α-triol.通过小叶中国蕨与银粉背蕨的化学成分对比，确定了这两种植物化学成分不同，而不能作为民间的通经草（银粉背蕨）药材混用.该研究充分体现了小叶中国蕨植物化学研究的必要性，也为小叶中国蕨及其他粉背蕨属蕨类植物的深入研究提供了理论与数据参考.

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（責任编辑：顾浩然，郁慧）

收稿日期： 2021-09-01

基金项目： 上海植物种质资源工程技术研究中心支持项目（17DZ2252700）

作者简介： 汤丽萍（1996—），女，硕士研究生，主要从事植物化学方面的研究. E-mail： 1286531918@qq.com

* 通信作者： 黄国正（1979—），男，副教授，主要从事天然药物化学和有机合成方法学方面的研究. E-mail： guozheng.huang@yahoo.com;曹建国（1968—），男，教授，主要从事植物生物学和植物资源学方面的研究. E-mail： cao101@shnu.edu.cn

引用格式： 汤丽萍， 姜天菊， 戴锡玲， 等. 小叶中国蕨中一种-贝壳杉烷型二萜化合物分离与结构表征 [J].上海师范大学学报（自然科学版），2022，51（1）：32‒38.

 TANG L P， JIANG T J， DAI X L， et al. Separation and structural characterization of an -kaurane diterpenoid from  [J]. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2022，51（1）：32‒38.