基于表型性状的菠菜核心种质构建
2022-03-09彭枫李阳戴雨柔王雪美杨蛟王全华蔡晓锋
彭枫 李阳 戴雨柔 王雪美 杨蛟 王全华 蔡晓锋
摘 要： 以483份菠菜种质为材料，基于20个表型性状数据，根据2种遗传距离、3种取样方法、8种系统聚类方法、3种取样比例构建了144份菠菜核心种质.应用均值差异百分率、方差差异百分率、极差符合率和变异系数变化率4个参数来检验各取样策略的优劣. 通过比较核心种质和原始种质的变异系数、方差、多样性指数、符合率和主成分，对构建的核心种质进行代表性检验.结果表明：“欧氏距离+优先取样法+离差平方和法+15%的取样比例”取样策略最佳，其均值差异百分率、方差差异百分率、极差符合率和变异系数变化率分别为0，65%，100%和124.32%.核心种质与原始种质在20个指标上的均值符合率在95.08%～99.83%之间，最大值、最小值符合率均为100%，多样性指数符合率在83.94%～99.11%之间.原始种质和核心种质的前6个主成分相同，累积贡献率分别为69.563%和70.242%，表明所选出的72份菠菜核心种质能代表483份原始种质的表型变异特征性，有利于种质的保存和利用.
关键词： 菠菜; 核心种质; 表型性状; 种质资源
中图分类号： S 636.1 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2022）01-0009-11
Construction of spinachs core germplasms based on its phenotypic traits
Abstract：This study used 483 spinach germplasm as materials， based on 20 phenotypic traits， and based on 2 genetic distances， 3 sampling methods， and 8 systematic clustering method and 3 sampling ratios constructed 144 core collections of spinach. Four parameters， the percentage of mean difference， the percentage of variance difference， the coincidence rate of range， and the rate of variation of the coefficient of variation， were used to test the pros and cons of each sampling strategy. By comparing the coefficient of variation， variance， diversity index， coincidence rate and principal components of the core collection and the original collection， the representative test of the constructed core collection was carried out. The results show that：“Euclidean distance+priority sampling method+deviation square sum method+15% sampling ratio” sampling strategy is the best， and its mean difference percentage， variance difference percentage， range coincidence rate， and variation coefficient change rate are 0， 65%， 100%， and 124.32% respectively. The average coincidence rate of the core collection and the original collection on the 20 indicators is between 95.08% and 99.83%， the maximum and minimum coincidence rates are both 100%， and the diversity index coincidence rate is between 83.94% and 99.11%. The first six principal components of the original germplasm and the core germplasm are same， and the cumulative contribution rates are 69.563% and 70.242%， respectively. It shows that the 72 spinach core collections constructed can represent the phenotypic variation characteristics of 483 original collections to be utilized and preserved.
Key words：spinach; core germplasm; phenotypic trait; germplasm resource
菠菜（Spinacia oleraceaL.）屬于苋科藜亚科菠菜属一二年生草本植物[1]，原产于伊朗，2 000年前己有栽培记录[2].菠菜以叶片和嫩茎为食用器官，富含维生素和镁、铁等营养元素[3]，世界各地普遍种植，是我国栽培和食用最广泛的蔬菜之一，同时也是我国出口创汇的主要蔬菜之一[4-5].据联合国粮食及农业组织（FAO）2014年统计，我国菠菜年产量约2 500万t，占世界菠菜总产量的90%，是世界上最大的菠菜种植国家及消费国家[6].
种质资源的征集保存对作物新品种的选育、特异种质材料的利用，及种质创新具有重要意义[7].随着种质资源的不断积累，种质资源库变得越来越大，极大地提高了种质资源的管理费用，增加了特异种质材料筛选、挖掘的难度.BROWN和FRANKEL等[8-10]首次提出了核心种质（core collection）的概念以解决这一难题.核心种质是指从整个种质资源中选取一定数量的资源作为样本，以最小的样本数量最大限度地代表整个种质资源的多样性.构建核心种质为海量种质资源的深入评价、高效保护与利用提供了新的途径[11-13].如何有效地构建作物核心种质，使尽可能少的样品保存尽可能多的遗传变异，已是作物种质资源研究的一个新领域[14].目前，国内外已先后构建了甜菜[14]、水稻[15-16]、小麦[17-18]、玉米[19]、大豆[20]、番茄[21-23]等多种作物核心种质.同时，有关核心种质的取样比例、取样策略以及有效性评价等理论研究也取得了长足的进展，为核心种质的构建及代表性评价提供了理论依据[24-27].
菠菜栽培历史悠久，地域分布广泛，种质资源极为丰富，国内外研究者对菠菜种质资源进行了广泛的收集与利用[28].据荷兰遗传资源中心KIK博士报道，目前收集的菠菜种质资源共计1 938份[29].国内外对菠菜核心种质构建方法进行的系统研究尚未见报道.本研究通过对上海师范大学种质资源中心前期收集的、具有代表性的483份菠菜种质资源的20个表型性状进行田间调查，然后基于表型数据进行遗传多样性分析和核心种质的构建，并对其代表性进行了评价，最终确定核心种质，以更有效地利用现有种质资源，去除冗余和重复材料，优化菠菜基因库结构，为菠菜种质资源的保存、改良和新品种选育提供了科学依据.
1 材料与方法
1.1实验材料
实验材料为上海师范大学种质资源中心园艺系蔬菜课题组收集并保存的483份菠菜种质资源材料.
1.2实验设计
实验于2018年10月—2019年5月在上海師范大学植物种质资源开发中心生物基地进行.2018年10月31日将种子播于96孔穴盘中育苗，基质为草炭和蛭石（质量比为3∶1），进行催苗处理，育苗初期，每2～3 d浇1次水.“两叶一心”后每天浇1次水，每3 d施用1次氮钾肥;12月22日（5～6片真叶），将小苗移植在大棚中.成熟后，以每个种质资源为单位，进行性状调查.
1.3表型性状调查与方法
表型性状调查内容与分级标准参照《菠菜种质资源描述规范和数据标准》[30]，调查株型、株高、株幅、花期等20个性状.
1.4数据处理
采用Excel计算20个性状的平均值、标准差、最大值、最小值、多样性指数和符合率，符合率为
其中，rc为核心种质的某一性状参数;r0为原始种质的某一性状参数[31].利用PAST 2.17软件进行主成分分析，主成分分析采用均值化的数据.采用Shannon-Weaver指数计算表型性状的多样性指数
其中，Pi为某一性状出现的概率[32].利用核心种质抽取软件QGA 2.0进行核心种质的抽提[33-35].
1.5核心种质的评价
本研究基于均值差异百分率（MD）、方差差异百分率（VD）、极差符合率（CR）和变异系数变化率（VR）4个评价参数评价所构建核心种质的代表性，从中筛选出最佳取样策略.并利用表型性状的方差、极差、均值和变异系数等指标，多样性指数检验法、符合率检验法、主成分分析法等方法验证所构建菠菜核心种质是否能够代表原种质资源的遗传多样性.
2 结果与分析
2.1确定最佳取样策略
采用马氏（Mahalanobis）距离和欧氏（Euclidean）距离2种遗传距离，随机取样法（random）、优先取样法（preferred）和偏离度取样法（deviation）3种取样方法，15%，20%和25% 3种取样比例，最短距离法（single）、最长距离法（complete）、中间距离法（median）、重心法（centroid）、可变类平均法（weighted）、可变类平均法（flexible）、不加权类平均法（unweighted）、离差平方和法（ward）8种聚类方法，分别在144种取样策略下构建了核心种质.根据MD，VD，CR和VR 4个评价参数，从144种取样策略中选出评价参数最佳的取样策略.
2.2.1 遗传距离比较
由不同方法构建的144份核心种质中，117个核心种质的MD小于20%，CR大于80%，说明这117个核心种质能够代表原群体的遗传多样性.比较2种遗传距离发现，采用欧氏距离构建的核心种质VD，VR普遍优于采用马氏距离构建的核心种质.在优先取样法下，采用马氏距离构建的核心种质的CR虽也达到100%，但其VD和VR明显低于采用欧氏距离构建的核心种质.以上分析表明，在菠菜核心种质构建中，采用欧氏距离优于马氏距离.
2.2.2 取样方法比较
表1为菠菜核心种质筛选评价参数，由表1可知：采用欧氏距离，在不同抽样比例、不同聚类方法下，随机取样法构建的核心种质的各评价参数均劣于优先取样法和偏离度取样法.其具有相对较小的VD，CR和VR，不能尽可能多地保存原群体的遗传变异，因此随机取样法不太适合于构建菠菜核心种质.优先取样法的CR均为100%，完全保存了原群体的变异幅度，同时又具有相对较高的VD和VR，因此本实验采用优先取样法构建菠菜的核心种质.
2.2.3 聚类方法比较
对于欧氏距离，利用优先取样法，采用8种聚类方法构建菠菜核心种质，结果发现：用最短距离法的核心种质MD都大于20%，应首先排除;在各个取样比例下，用离差平方和法得到的核心种质的VD和VR都是最大的，因此离差平方和法的聚类效果较好.
2.2.4 取样比例确定
采用欧氏距离，利用离差平方和法进行聚类，结合优先取样法取样，按照15%，20%，25% 3个取样比例抽取3个核心种质（表1），发现MD均为0，CR均为100%，VR逐渐减小，且VD在取样比例为15%时最高，因此15%是构建菠菜核心种质最适宜的取样比例.
综上所述，应选择“欧氏距离+优先取样法+离差平方和法+15%的取样比例”的策略构建菠菜核心种质.
2.2核心种质验证
2.2.1 核心种质与原群体间的遗传差异
利用均值、极差、表型方差、变异系数等评价了核心种质的代表性（表2）.由表1及表2可知：核心种质库与原始群体相比，MD为0，20个性状的均值都没有显著差异;各性状的CR为100%，表明核心种质对原始种质中的特异种质保留效果较好;各性状的VR为124.32%，除叶片挺直度、叶基外，18个性状的VR均高于原始种群，表明核心种质具有良好的异质性;各性状的VD为65%，叶褶皱、叶柄色、株幅、叶柄宽的方差显著高于原始种质，株型、叶色、单株叶数、株高、叶片长、叶片宽、叶柄长、抽薹期、开花期的方差极显著高于原始种质，表明核心种质获得了更大的变异.
2.2.2 核心种质与原始种质的符合率检验
核心种质与原始种质的均值、最大值、最小值和多样性指数符合率详见表3.核心种质与原始种质的均值符合率在95.08%～99.83%之间，多样性指数符合率在83.94%～99.11%之间.说明所构建的核心种质可以代表原始种质在20个表型性状上的遗传多样性;最大值、最小值的符合率均为100%，说明核心种质保留了原始种质中的特异种质.
2.2.3 核心种质与原始种质的主成分分析
核心种质和原始种质的主成分分析详见表4，分析可知两者具有相似的特征值、贡献率和累积贡献率.以特征值大于1为标准[36]，原始种质入选5个主成分，核心种质入选6个主成分.原始种质和核心种质的前6个主成分的累积贡献率分别为69.563%和70.242%，说明建立的核心种质能够排除遗传冗余，使贡献率和累积贡献率略有所提升.
3 讨 论
目前，很多育种和相关科研工作者都会广泛收集种质资源，但种质资源的保存利用技术尚不成熟，因此，构建核心种质是种质资源工作的重要内容，核心种质以最少的种质数量包含原群体的全部或大部分的遗传变异，可以解决种质资源数量庞大、不易保存等问题.MIAO等[37]综述了园艺作物核心种质构建的研究新进展与展望，表明种质分组及取样策略是园艺作物核心种质构建方法研究的重点.
遗传距离是度量群体间遗传相似性的综合数量指标，不同遗传距离的计算方法直接影响样品的聚类结果和核心种质的构建.目前，在核心种质构建过程中，最为常用的是欧氏距离和马氏距离.GAO等[38]采用标准化的数据，利用欧氏距离结合类平均距离法构建了中国果梅的核心种质.WANG等[24]在采用标准化的数据比较不同遗传距离对构建棉花核心种质的影响时也发现，欧氏距离优于马氏距离，与本研究结果一致.聚类分析常应用于种质资源亲缘关系研究[39].常用的聚类方法有最短距离法、最长距离法、中间距离法、重心法、可变类平均法、可变类平均法、不加权类平均法、离差平方和法等.不同的聚类方法在不同的作物中均有成功构建核心种质的报道[40].本研究比较了8种聚类方法，得出采用离差平方和法构建的菠菜核心种质具有较大的遗传变异，明显优于其他方法，这与ZHANG[41]和DONG等[42]的研究结果一致.
取样方法一直是核心种质研究的重点，因为它决定哪一个株系有资格入选为核心种质.XU等[43]對棉花核心种质的研究表明，优先取样法和偏离度取样法都能明显提高核心种质的方差，但是优先取样法先抽取具有性状最大或最小值的样品作为核心样品，有利于保存一些特异材料，构建的核心种质能完全保存原群体的极差，略优于偏离度取样法.本研究对比了这3种取样方法，得出相同结论.确定合理的取样比例也是构建作物核心种质的重要环节，LI等[44]认为取样比例应根据具体物种遗传结构及数量规模状况而定.农作物因原始群体大，取样比例多为5%～15%[8]，而园艺植物构建核心种质的取样比例较大，一般为10%～30%[37].取样比例的大小还与原种质调查性状的数量有关.本研究比较了3种取样比例（15%，25%和25%），其中用取样比例15%获得72份材料的菠菜核心种质，既保留了原种质的遗传多样性，又便于管理和利用，是适宜的取样比例.
表型水平的遺传多样性检验常采用均值、方差、极差和变异系数等指标进行检验[45].BASIGALUP等[46]认为极差和方差越大，代表性越强.QIAN等[47]用最大值、最小值、均值、标准差和变异系数作为检验棉花核心种质的代表性和遗传多样性的参数.XU等[48]认为在评价构建核心种质取样方法间优劣时，多样性指数是重要参数.胡晋认为合理的核心种质需同时满足均值差异百分率小于20%和极差符合率参数大于80%的条件[26].并且，均值差异百分率越小，方差差异百分率、极差符合率和变异系数变化率越大，对原始种质的代表性越强[49-50].目前，国内根据表型数据构建核心种质时，大多采用胡晋的评价方法，或结合其他一些评价参数.本研究以胡晋的4个评价参数为主，结合表型多样性指数检验、符合率检验法和主成分分析法等方法获得的菠菜核心种质的各个参数较优，代表性较强.
表型性状数据能够真实反映材料遗传多样性，是传统的构建核心种质的方法.但表型性状由于受环境影响较大，利用表型值度量的材料间遗传距离不能准确、真实地反映材料间基因型的遗传差异[51].近年来分子标记技术不断成熟完善，分子标记数据能相对更真实地反映资源的遗传多样性和亲缘关系，利用分子标记技术构建核心种质是研究热点.但单纯使用分子标记数据构建核心种质会造成表型遗传多样性的丢失[41，52-53].CHANG等[54]将分子标记与表型数据相结合进行核心种质的构建，分别筛选出14个超甜玉米核心材料和19个普甜玉米材料作为核心种质，构建的甜玉米核心种质最大限度地保留了原始群体的遗传多样性和表型变异，能够有效地代表原始甜玉米材料群体.因此，下一步工作应继续采集菠菜分子标记数据，整合表现型和基因型数据，构建更加完善的菠菜核心种质，为菠菜的高产、优质、抗逆等优质种质资源的挖掘提供便利.
4 结 论
本研究利用483份菠菜原始种质材料的20个表型性状数据构建核心种质，优化的系统聚类方法为离差平方和法结合优先取样法，采用15%的取样比例、欧氏距离，最终获得包含72份材料的核心种质. 该核心种质各项评价参数优良，能够代表原始种质的遗传多样性，主成分信息得到保留，并且很好地去除了原种质的遗传冗余，可以优先作为后续菠菜种质资源研究的材料.
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（責任编辑：顾浩然，冯珍珍）
收稿日期： 2021-10-03
基金项目： 上海市科研创新行动计划项目（19070502600）;上海市科技兴农项目（沪农科推字（2021）第1-14号）;上海植物种质资源工程技术研究中心项目（17DZ2252700）;上海市协同创新中心项目（ZF1205）;上海市植物分子科学实验室项目（18DZ2260500）
作者简介： 彭 枫（1996—），男，硕士研究生，主要从事蔬菜遗传育种及分子生物学方面的研究. E-mail： 13816873387@126.com*通信作者： 蔡晓锋（1986—），男，教授，主要从事蔬菜遗传育种及分子生物学方面的研究. E-mail： cxf0012@163.com
引用格式： 彭枫， 李阳， 戴雨柔， 等. 基于表型性状的菠菜核心种质构建 [J]. 上海师范大学学报（自然科学版），2022，51（1）：9?19.
Citation format： PENG F， LI Y， DAI Y R， et al. Construction of spinachs core germplasms based on its phenotypic traits [J]. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2022，51（1）：9?19.
