烟草镰刀菌根腐病拮抗细菌的筛选鉴定及促生防病效果

邱 睿，李小杰，李成军，邢国珍，房文祎，李彩虹，张盈盈，姚晨虓，徐 敏，李芳芳，宋瑞芳，郑文明，李淑君*，申 欣，张东锋

烟草镰刀菌根腐病拮抗细菌的筛选鉴定及促生防病效果

邱 睿1，李小杰1，李成军1，邢国珍2，房文祎1，李彩虹1，张盈盈1，姚晨虓1，徐 敏3，李芳芳3，宋瑞芳3，郑文明2，李淑君1*，申 欣4，张东锋5

（1.烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室，河南省农业科学院烟草研究所，河南 许昌 461000；2.河南农业大学生命科学学院，郑州 450002；3.中国烟草总公司河南省公司，郑州 450018；4.河南省烟草公司洛阳市公司嵩县分公司，河南 嵩县 471400；5.河南省烟草公司许昌市公司建安分公司，河南 许昌 461000）

为挖掘对烟草镰刀菌根腐病具有较强拮抗作用的生防菌株，采用稀释涂布平板法从健康烟株根际土壤中分离纯化对烟草镰刀菌根腐病（root rot）主要病原具有一定拮抗作用的细菌，进行形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定，并测定促生防病效果。经平板对峙测定，筛选出2株对烟草镰刀菌根腐病病原具有较好抑制作用的菌株YX53和YX72，对茄病镰刀菌（）的抑制效率分别为83.66%和73.54%，对尖孢镰刀菌（）的抑制效率分别为57.57%和55.89%；2菌株无菌发酵滤液对病原孢子萌发抑制率为84.82%～100%，其挥发性化合物可抑制病原菌丝生长或产孢，且对烟草疫霉菌（）、根串珠霉菌（）等也有抑制效果。鉴定结果表明，YZ53和YX72分别为蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。经2菌株处理的烟苗胚根增长率分别达到了67.86%和161.61%，盆栽烟苗根长、最大叶面积、鲜质量等均有所增加；YX53盆栽防病效果在89.47%以上，YX72在99.53%以上。

烟草；镰刀菌根腐病；芽孢杆菌；促生作用；抑菌效果

我国是烟草种植面积最大的国家[1]，病害一直是影响我国烟草生产的重要因素之一[2]。近年来随着气候条件、土壤微生态和耕作制度等的变化，烟草镰刀菌根腐病已成为危害烟草生产的主要根茎类真菌病害[3-5]。引起烟草镰刀菌根腐病的主要病原菌是尖孢镰刀菌（）和茄病镰刀菌（）[6]。目前防治作物镰刀菌根腐病的主要策略是选用抗病品种和化学防治，但抗病种质资源有限、选育周期长，而化学防治则会造成环境污染、农药残留、病原菌产生抗药性等问题[7]，且长期大量使用化学农药还可加速病菌群体遗传结构生理分化和变异[8]。近年来生物防治已成为防治植物病虫害的重要手段[9]。何明川等[10]分离到的枯草芽孢杆菌（）MC4-2对烟草黑胫病的盆栽防效达到63.86%。翟颖妍等[11]报道了芽孢杆菌ZYY-4对烟草炭疽病具有高生物活性。许乐等[12]获得的内生多粘类芽孢杆菌（）DS-R5通过抑制腐皮镰刀菌孢子萌发，破坏菌丝结构和内部细胞器抑制病原菌生长，对丹参根腐病的盆栽防效可达到61.4%。目前鲜见关于烟草镰刀菌根腐病生防细菌的系统筛选及其作用机制的相关研究。因此，本研究通过对健康烟株根际土壤微生物的分离、筛选，获得对烟草镰刀菌根腐病主要病原具有较好抑制作用的拮抗细菌菌株，明确其种类，测定其防效及对烟草的促生效果，为开发烟草镰刀菌根腐病高效生防制剂提供资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年5月至2022年4月在烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室进行。供试土样分别采自河南许昌襄城县（褐土）、三门峡卢氏县（黄棕壤）和渑池县（红粘土）。供试烟草品种中烟100。烟草镰刀菌根腐病病原菌尖孢镰刀菌B-9-1（）、茄病镰刀菌A-4-9（）、烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病变种（烟草疫霉）、烟草根黑腐病病原菌烟草根串珠霉（）、烟草白绢病菌（）、烟草立枯病病原菌立枯丝核菌（）、鸢尾丝囊霉菌（）及烟草溃疡病病原菌葡萄座腔球菌（）均由河南省农业科学院烟草研究所提供。土壤细菌分离纯化采用1/2 LB固体培养基，拮抗细菌发酵使用LB液体培养基，烟草病原真菌培养用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）[13]。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗细菌分离筛选 分别于2021年5—8月从豫中和豫西烟田病株周边健株根际采集根际土样40份。采用稀释涂布平板法分离纯化菌株[14]，参照宋光桃等[15]的平板对峙法进行拮抗菌筛选，根据抑菌带宽度确定拮抗程度，选取拮抗效果好的菌株进行复筛。测量菌落半径，计算抑菌率。

1.2.2 拮抗菌株无菌发酵滤液的抑菌活性测定 拮抗菌株无菌发酵滤液的制备：将对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌平均抑菌率大于50%的菌株活化后，参照千慧敏等[16]的方法制备菌液原液。将上述菌液原液12000 r/min离心10 min，上清液用细菌过滤器（0.22 μm）过滤2次后得到无菌发酵滤液。

拮抗菌株无菌发酵滤液对病原菌菌丝生长的影响：用打孔器在直径9 mm的培养皿距离中央2.5 cm处均匀打3个孔，每孔注入200 μL的发酵滤液，以无菌的LB液体培养基为对照，待发酵液被培养基吸收完全后，在培养基中心接直径5 mm的病原菌菌块，每个处理重复3次。28 ℃黑暗培养7 d后，测量对照组和处理组病原菌菌落半径，计算相对抑菌率。

拮抗菌株无菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响：采用无菌发酵滤液与分生孢子共培养法[17]测定拮抗菌株对镰刀菌分生孢子的影响，以无菌LB液体培养基处理为对照，每个处理重复3次，统计对照和处理组病原孢子萌发情况，计算孢子萌发率。

1.2.3 拮抗菌株挥发性化合物的抑菌活性测定 参照江木兰等[18]的方法测定拮抗菌株挥发性化合物对烟草镰刀菌根腐病病原的抑制作用。以空白的LB平板为对照，每个处理重复3次。28 ℃黑暗培养7 d，测定对照组和处理组病原菌菌落直径，计算相对抑菌率，并在显微镜下观察各处理产孢情况。

1.2.4 拮抗菌株抑菌谱的测定 采用平板对峙培养法[15]（略有改动，平行划线改为对称点接种），进行拮抗菌株对8种烟草病原真菌抑菌试验，每个处理3次重复。

1.2.5 拮抗菌株的鉴定 参照董秀珠等[19]的《常见细菌系统鉴定手册》进行形态学鉴定，利用芽孢杆菌鉴定试剂盒HIBacillusTM Identification Kit进行生理生化鉴定。参考千慧敏等[17]方法进行分子生物学鉴定，应用NCBI进行序列比对分析，采用MEGA 7.0软件的Maximum likelihood法构建系统发育树。

1.2.6 拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定 参照姚晨虓等[20]的培养皿滤纸保湿法进行测定，以无菌水处理的消毒种子为对照，每皿25粒种子（5×5），重复3次，第10天统计种子萌发率及测量种子胚根长度，计算增长率。

增长率=（处理组根系长度-对照组根系长度）/对照组根系长度×100%

尾水渠开挖总的施工程序是自上而下施工，先覆盖层，后石方无用料开挖，再进行石方有用料(用于堆石坝填筑)分层开挖。半河床半河岸段，逆水流方向分段开挖。分段长度约200m。各级开挖边坡形成之前完成相应高程的地表及生态放流的引排水施工。

1.2.7 拮抗菌株盆栽促生试验 将1.2.2中离心得到的沉淀用无菌水重悬，将活菌浓度调至6×108CFU/mL。参考千慧敏等[16]的方法进行盆栽促生试验。20 d后，根据中华人民共和国烟草行业标准（YC/T 142—2010）[21]中的农艺性状测量方法，测定拮抗菌株对烟草农艺性状的影响，测量指标包括有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜质量和根系鲜质量，叶面积（cm2）=0.6345×叶长（cm）×叶宽（cm）。

1.2.8 拮抗菌株盆栽防病试验 取长势一致的3～4片真叶烟苗移栽至装有无菌基质的灭菌花盆（85 mm×70 mm）中培养2 d后，进行拮抗菌悬浮液（6×108CFU/mL）灌根，每株20 mL，灌根结束后48 h，在烟根周围分别接种预先培养好的带有靶标菌（尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌）的麦粒，5 g/株，接靶标菌后72 h，再次进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20 mL，以不做任何处理的烟株为阴性对照（CK1），只接病原菌为阳性对照（CK2），每处理15株。所有处理置于28 ℃、光暗周期16 h/8 h、相对湿度70%条件下培养。培养第20天参照国家标准（GB/T 23222—2008）[22]烟草病害分级及调查方法进行发病情况调查，计算病情指数及拮抗菌防效。

病情指数=Σ（病级数×该病级植株数）/（最大病级数×植株总数）×100

防治效果=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100%

1.3 数据统计与分析

数据处理采用Excel和DPS 7.05软件分析，方差分析采用Duncan新复极差法。

2 结 果

2.1 拮抗菌株的分离筛选

经稀释涂布平板法，从40份土壤样品分离纯化得到42株细菌。以烟草镰刀菌根腐病主要病菌为靶标，经平板对峙法进行初筛和复筛，筛选出5株对病原菌有拮抗效果的菌株。从表1看出，YX53和YX72对尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑菌率显著高于CK及其他菌株，达到55.89%～83.66%。

表1 拮抗菌株对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑菌效果

注：表中数据为3次重复的平均值±；同列数据后的不同小写字母表示差异显著（<0.05）；下同。

Note: the data in the table were means±. The different lowercase letters in the table represents 5% significant difference level (<0.05). The same below.

2.2 拮抗菌无菌发酵滤液的抑菌活性测定

由图1看出，YX72的发酵滤液对尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的菌丝生长具有抑制作用。2株拮抗菌株发酵滤液均能抑制病原菌孢子萌发，LB液体培养基处理病原菌孢子萌发率达到45%以上，拮抗菌发酵滤液处理孢子萌发率仅有0%～7.21%，其中YX72发酵滤液可完全抑制茄病镰刀株菌孢子萌发（表2）。

图1 拮抗菌无菌发酵液的抑菌活性

表2 拮抗菌无菌发酵液对病原菌孢子萌发的影响

2.3 拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定

由表3看出，2株拮抗菌株挥发性有机化合物（VOCs）对茄病镰刀菌菌丝生长的抑菌率约为26%。2株拮抗菌VOCs影响病原产孢，YX53和YZ72挥发性化合物处理过的和产孢量显著低于对照，对病原产孢抑制率达93.95%～100%（图2）。

2.4 拮抗菌株对烟草病原的抑菌谱测定

表4表明，2株拮抗菌对供试的8种烟草根茎类真菌病害病原菌均有不同程度的抑制作用。2菌株对茄病镰刀菌的平均抑菌率均大于70%，对尖孢镰刀菌和烟草疫霉菌的抑菌率均大于50%，菌株YX72对烟草根串珠霉和鸢尾丝囊霉菌的抑菌率约55%，对烟草白绢病菌、立枯丝核菌和葡萄座腔球菌的抑菌率为42.06%～47.64%；菌株YX53对烟草根串珠霉等5种病原菌的抑菌率低于YX72，抑菌率为23.81%～43.30%。

2.5 拮抗细菌的鉴定

2.5.1 形态学及生理生化鉴定 图3显示，菌株YX53为革兰氏染色阳性，在LB培养基上28 ℃黑暗培养48 h，菌落近圆形，无色素，圆心白色微凸，边缘乳白色，显微观察菌体细胞杆状，末端钝圆，成短或长链，（1.0～1.2）μm×（3.0～5.0）μm，符合蜡样芽孢杆菌特征；菌株YX72革兰氏染色阳性，在LB培养基上28 ℃黑暗培养48 h，菌落表面粗糙不透明，白色，显微观察菌体细胞长杆状，单个或链状排列，单个细胞（0.7～0.8）μm × （2.0～3.0）μm，符合枯草芽孢杆菌特征。表5结果表明，YX53和YX72生理生化特性分别与蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌一致。

表3 拮抗菌株VOCs对病原菌的抑制效果

图2 拮抗菌挥发性化合物对病原菌产孢的影响

表4 两株拮抗菌株对8种病原菌抑菌效果

Table 4 Inhibitory effects of the 2 strains on the 8 plant pathogens

菌株Strains指标Index尖孢镰刀菌F. oxysporum茄病镰刀菌F. solani烟草疫霉P. nicotianae烟草根串珠霉T. basicola烟草白绢病菌S. rolfsiii Sacc立枯丝核菌R. solani鸢尾丝囊霉菌A. iridis葡萄座腔球菌B.dothide YX53菌落半径/cm 1.73±0.12b0.80±0.06c1.93±0.03b2.40±0.06b3.30±0.06b3.20±0.06b3.03±0.03b2.53±0.03b 抑菌率/%60.17±3.48a80.96±1.25a54.50±1.07a43.30±1.44b23.85±0.88b23.81±1.37b29.45±0.48b40.62±0.68b YX72菌落半径/cm1.87±0.09b1.13±0.09b1.90±0.06b1.97±0.03c2.33±0.12c2.43±0.03c1.90±0.06c2.23±0.12c 抑菌率/%57.30±1.17b72.97±2.39b55.31±1.06a53.54±0.69a46.18±2.51a42.06±0.79a55.82±1.17a47.64±2.94a CK菌落半径/cm4.37±0.09a4.20±0.06a4.25±0.03a4.23±0.03a4.33±0.03a4.20±0.00a4.30±0.06a4.27±0.03a 抑菌率/%————————

注：A和B为YX53和YX72菌落形态，A’和B’为对应菌体细胞结构。

Note: A and B is the colony morphology of YX53 and YX72, A’ and B’is the cell structure of corresponding bacteria.

图3 拮抗菌株形态特征

Fig. 3 Morphological characteristics of the 2 strains

表5 芽孢杆菌鉴定试剂盒检测结果

注：“+”表示阳性，“−”表示阴性，“D”表示延迟。Note: “+” means positive, “−“ means negative, “D” stand for delay.

2.5.2 分子生物学鉴定 将PCR获得的待测菌株16S rDNA序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，结果显示，菌株YX53（ON497154）与蜡样芽孢杆菌（）EH11（MN750766.1）等的序列相似性达到100%，YX72（ON497155）与枯草芽孢杆菌（）MK736112.1（MT111083.1）等的序列相似性达到100%。从图4看出，YX53和YX72分别与蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌聚于同一分支。结合形态学和生理生化鉴定，鉴定YX53和YX72分别为芽孢杆菌属的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。

图4 基于16S rDNA构建的系统发育树

2.6 拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定

从图5可知，菌株YX72处理的烟草种子萌发率与对照基本一致，YX53处理种子萌发率低于CK，3个处理间无显著差异（＜0.05）。表6表明，拮抗菌处理的烟苗胚根较CK均有不同程度增长，以YX53处理组胚根发育最好，烟苗胚根增长率达到161.61%，YX72处理组烟苗胚根增长率达到了67.86%。

图5 拮抗菌对种子萌发率的影响

表6 拮抗菌对烟草根系发育的影响

2.7 拮抗菌株对盆栽烟草的促生作用

从表7可知，YX53处理盆栽烟株最大叶面积、地上鲜质量、根系鲜质量、总根长和总根表面积较对照分别提高了32.55%、46.61%、67.11%、168.20%和94.55%，YX72处理烟株最大叶面积、地上鲜质量、根系鲜质量、总根长和总根表面积较CK分别提高了73.88%、103.58%、153.69%、231.89%和109.09%，对烟株促进作用较YX53强。

2.8 拮抗菌对盆栽烟草镰刀菌根腐病的防病效果

由表8看出，CK1处理烟株不发病，只接种病原菌的处理CK2烟株发病率为100%，病情指数达到53以上。与CK2相比，YX53和YX72发酵液处理烟株的发病率在0.00%～23.34%，YYX53对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌根腐病的平均防效分别为89.47%和99.35%，略低于YX72的99.53%和100%，说明菌株YX53和YX72对烟草镰刀菌根腐病具有显著的防治效果。

表7 拮抗菌对盆栽烟草的促生效果

表8 拮抗菌株对烟草镰刀菌根腐病的防治效果

3 讨 论

生防菌广泛应用于农业生产病害防治[23]，目前关于烟草镰刀菌根腐病生防资源筛选利用的研究报道较少，谯天敏等[24]研究表明蜡样芽孢杆菌（）Y6对尖孢镰刀菌（）的抑菌率为30.6%；李姝江等[25]筛选的蜡样芽孢杆菌B3对茄病镰刀菌（）具有较强的拮抗作用，抑菌带达26.0 mm，盆栽防效为25.57%～97.56%；倪方方等[26]研究表明枯草芽孢杆菌（）对白术尖孢镰刀菌的平板对峙抑菌率为52.3%，盆栽防效36.33%；姚凤琴等[27]报道了枯草芽孢杆菌Bv17对茄病镰刀菌的平板抑菌率为85.44%，盆栽防效70.52%～97.32%。本研究筛选的蜡样芽孢杆菌YX53和枯草芽孢杆菌YX72，对尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的平板抑菌率为55.89%～ 83.66%，盆栽防效达到89.47%～100%，优于已报道的其他蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，这可能是因为本研究从烟株根际土壤中筛选出的拮抗菌株对烟田土壤环境和烟株具有更强的适应性[28]，能更好地在烟草根际定殖并发挥作用。

芽孢杆菌可通过形成抑菌物质、合成促生长激素促进植物生长发育、诱导系统抗性等，提高植物抗病能力[23,29]。ZHAO等[30]研究表明枯草芽孢杆菌CF-3的挥发性化合物和发酵滤液对胶孢炭疽菌孢子萌发的抑制率分别为70.11%和57.36%；黄秋斌等[31]报道的蜡样芽孢杆菌0-9对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑菌率为50%，其代谢物对尖孢镰刀菌分生孢子萌发的抑制率为61.2%。卫甜等[32]研究表明，枯草芽孢杆菌BT-6和蜡样芽孢杆菌JJN2可提高水稻种子苗长和促进幼苗生长，苗长和鲜质量增长率最大达到20.79%；钟泽翔[33]筛选的13株枯草芽孢杆菌处理下，黄瓜种子胚根根长和幼苗鲜质量增幅分别达3.62%～55.32%和5.66%～27.45%。本研究表明，菌株YX53和YX72的无菌发酵滤液对尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌孢子萌发抑制率为84.82%～100%，其挥发性化合物对尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌产孢抑制率达93.95%～100%；YX53和YX72处理烟苗胚根根长和烟株鲜质量分别增加了67.86%～161.61%和46.61%～153.69%，其抑菌促生作用显著优于已报道的其他枯草和蜡样芽孢杆菌。菌株YX53、YX72对烟草疫霉、根串珠霉等6种烟草真菌病原菌也有较好的抑菌作用，表明枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌抑菌谱广，与前人研究一致[31-32]。

4 结 论

本研究筛选鉴定出对烟草镰刀菌根腐病具有较好防治作用的蜡样芽孢杆菌YX53（）和枯草芽孢杆菌YX72（），盆栽防效达到89.47%以上。2株芽孢杆菌可通过抑制病原菌丝生长、病原孢子萌发和病原产孢等抑制病原菌生长发育，同时可促进烟株生长发育，提高烟株抗病性，为烟草镰刀菌的生物防治提供了新的菌种资源。

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Screening and Identification of Antagonistic Bacteria against TobaccoRoot Rot and Evaluation of Their Effects on Growth Promoting and Disease Control

QIU Rui1, LI Xiaojie1, LI Chengjun1, XING Guozhen2, FANG Wenyi1, LI Caihong1, ZHANG Yingying1, YAO Chenxiao1, XU Min3, LI Fangfang3, SONG Ruifang3, ZHENG Wenming2, LI Shujun1*, SHEN Xin4, ZHANG Dongfeng5

(1. Key Laboratory for Green Preservation & Control of Tobacco Diseases and Pests in Huanghuai Growing Area, Tobacco Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Xuchang, Henan 461000, China; 2. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 3. Henan Provincial Tobacco Company, Zhengzhou 450018, China; 4. Songxian Branch, Luoyang Company of Henan Tobacco Company, Songxian, Henan 471400, China; 5. Jian’an Branch, Xuchang Company of Henan Tobacco Company, Xuchang, Henan 461000)

In order to screen for strains that have good antagonistic effects on tobaccoroot rot, bacteria that have good antagonistic effects were isolated and purified from the rhizosphere of healthy tobacco by the dilute coating plate method. Antagonistic bacteria were identified by morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis, and the growth promotion and disease control effects were determined. Two bacterial strains YX53 and YX 72 that have good antagonistic functions were selected. The plate inhibitory test showed that the inhibition efficiency of YX53 and YX72 were 83.66% and 73.54% against, 57.57% and 55.89% against, respectively. The inhibition rate of YX53 and YX72 fermentation broth on pathogenic spore germination was 84.82%-100%, and the volatile organic compounds of the two antagonistic strains could inhibit the growth of pathogenic filaments or sporulation, also they had inhibitory effects on tobacco root disease pathogens such as,, etc. YX53 and YX72 were identified asand, respectively. The two strains had significant growth promotion and disease inhibition effects. The radicle growth rate of the tobacco seeds treated with YX53 and YX72 reached 67.86% and 161.61%, respectively. And the root length, the maximum leaf area and fresh weight etc. of the treated seedlings were all increased. The disease prevention effects of YX53 and YX72 were more than 89.47% and 99.53% respectively.

tobacco;root rot;spp.; growth promotion; inhibitory effect

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.005

S435.72

A

1007-5119（2022）06-0031-08

河南省烟草公司科技项目（2020410000270012）；河南省农业科学院优秀青年科技基金计划项目（2022YQ09）；河南省农业科学院科技创新团队（2022TD26）；河南省高等学校重点科研项目计划（20B210009）

邱 睿（1984-），女，助理研究员，主要从事烟草镰刀菌根腐病绿色防控相关工作。E-mail：qiurui19840414@hotmail.com

，E-mail：13603749396@126.com

2022-05-18

2022-09-22