烟草根茎部病原真菌的分离与鉴定

刘 茜，李义婷，蔡刘体，张长青，尹军良*，汪汉成*

烟草根茎部病原真菌的分离与鉴定

刘 茜1,2，李义婷1，蔡刘体2，张长青1，尹军良1*，汪汉成2*

（1.长江大学农学院，湖北 荆州 434025；2.贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081）

为系统了解烟草根茎部主要病原真菌，采集根茎部发黑腐烂病株进行室内分离与鉴定，共分离到病原真菌64株。根据菌落、菌丝和孢子形态特征观察以及多基因位点系统发育分析对病原菌进行分类鉴定，并在烟草叶、茎和根部进行病原菌致病力测定。结果表明，分离得到的病原菌包括：尖孢镰刀菌（）、接骨木镰刀菌（.）、共享镰刀菌（.）、苏拉威镰刀菌（.）、柑橘镰刀菌（.）、番薯镰刀菌（.）、条纹孢壳属（）、小孢根霉（）和枝状枝孢菌（）。致病力测定表明，这些病原真菌对烟草都有致病力，其中接骨木镰刀菌、尖孢镰刀菌、共享镰刀菌和的致病力较强，苏拉威镰刀菌、番薯镰刀菌、柑橘镰刀菌、小孢根霉和枝状枝孢菌致病力稍弱。病原真菌的分离与鉴定结果将为科学、合理、有效地防治烟草根茎部病害提供依据。

根茎部病害；镰刀菌属；条纹孢壳属；根霉属；枝孢属

烟草是重要的经济作物，然而，烟草的产量和品质受到病害的严重威胁，年损失高达7亿元[1-2]。目前，由于烟草品种较为单一，且连年连片种植，导致烟草根茎部病害愈发严重，烟叶的产量和品质受到严重影响[3]。由镰刀菌侵染烟草引起的根腐病在美国、韩国、加拿大、澳大利亚、南非等产烟国普遍发生。近两年镰刀菌根腐病在我国烟区（云南、河南、贵州、湖北、安徽等地）的发病范围和发病程度呈上升趋势，病情严重的烟田发病率高达30%以上[4-6]，往往成为地区毁灭性的病害[7]。由于对病原菌的认识不清楚，导致用药缺乏针对性，防效不佳，过度用药则造成环境污染和病原菌抗药性增强，给病害防治工作增加了难度。目前，有关根茎部主要病原菌种类鉴定、菌株致病力的差异等均缺乏系统的研究[8]。而明确病原菌的种类及致病力是科学有效防治烟草根茎部病害的基础。因此，本试验采集根茎部腐烂发黑的烟草病株，对其病原真菌进行了分离；通过形态特征、分子系统发育分析以及人工接种后的发病症状，明确这些病原真菌的种类和致病力，为烟草根茎部病害的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病样采集 2020年8月在贵州省正安县四联村（28° 57' N，107° 28' E）和凤冈县熊坪村（27° 72' N，107° 71' E）、广西上林县东礼村（23° 43' N，108° 61' E）采集烟田根茎部发黑腐烂的病株，分别获得32、28和77个样品。

1.1.2 烟草材料 品种为云烟87（贵州烟草科学研究院提供），于温室种植（22 ℃，相对湿度>85%，16 h光照/8 h黑暗）。长至8叶期时，在叶部（从上至下第3～4叶位）、茎部和根部进行致病力测定。

1.2 试验方法

1.2.1 病原真菌的分离 参照李小杰等[3]的方法，将发病根茎用自来水冲洗干净，沥干水后，先后用75%的酒精棉球、无菌水和15%的次氯酸钠消毒，挑取长出的菌丝尖端转移至PDA培养基上培养，纯化好的单菌落编号保存。

1.2.2 病原真菌的形态学观察 参照何世芳等[1]的方法，将直径为6 mm的菌饼转接至新鲜的PDA培养基（90 mm）中央，25 ℃恒温黑暗培养。培养7 d后，观察菌落形态、颜色、质地等，拍照并用十字交叉法测量菌落直径。挑取培养菌丝和分生孢子制成临时水玻片，在微分干涉显微镜（NiKON DS-Ri2）下观察菌丝和分生孢子的形态。

1.2.3 病原真菌的系统发育分析 刮取菌丝至1.5 mL离心管中，参照刘海峰[9]的方法，快速提取基因组DNA，并以之为模板进行PCR扩增，获得ITS（ITS4，ITS5）[10]、（728F，986R；EF1，EF2）[11-12]、（512F，783R）[11]和（5F2，7CR）[13]的目的片段。PCR反应体系和反应程序参考HE等[14]的方法。PCR产物送至擎科基因生物科技有限公司测序。使用Phydit拼接序列，上传至NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对分析，下载同源性高的菌株信息，利用MEGA7软件，构建Neighbor-Joining（NJ）系统发育树（Bootstrap 1000）[15]，进一步鉴定分析。

1.2.4 病原真菌的致病力测定 进行烟草叶部、茎部和根部的致病力试验，叶部和茎部接种参考韩凤等[16]方法，根部接种参考邱睿等[5]方法，接种后放在温室中培养，7 d后统计病斑大小。重复3次，每次重复2株。对发病烟苗采用组织分离法重新分离，镜检观察分离物，完成柯赫氏法则验证。对照试验接种无菌的PDA培养基块。

2 结 果

2.1 病原真菌分离

根茎部病样进行病原真菌分离，共获得64株菌株。根据菌株菌落、菌丝及分生孢子的形态特征，初步将64株菌株鉴定为镰刀菌属（spp.）57株，条纹孢壳属（spp.）2株，根霉属（spp.）3株和枝孢属（spp.）2株[17-20]。

2.2 镰刀菌属病原菌分类鉴定

根据镰刀菌属病原菌菌株的菌落、菌丝、分生孢子形态（图1），初步将57个镰刀菌菌株分为6组。利用ITS和引物进行PCR扩增后，获得镰刀菌属代表菌株的基因片段，有效长度分别为453～533 bp、656～704 bp。得到的序列在NCBI上比对，结果表明有19株接骨木镰刀菌、1株番薯镰刀菌、6株苏拉威镰刀菌、6株柑橘镰刀菌、17株尖孢镰刀菌和8株共享镰刀菌。每个菌种随机选取一株，进行系统的形态特征描述、系统发育分析和致病力测定。

菌株GZAX 501（接骨木镰刀菌）7 d菌落直径可达90 mm，菌落圆形规则，白色气生菌丝呈絮状，琼脂中的色素为黄色（图1A1）；菌丝分枝少，有隔膜（图1B1）。CLA培养基上大型分生孢子呈无色镰刀形，大小均匀，顶端细胞较尖，足形基底细胞，3～5隔，多3隔，大小为（20.0～58.5）μm × （3.5～12） μm（图1C1）。

菌株GZAX 207（番薯镰刀菌）7 d菌落直径62 mm，白色菌落近圆形，边缘波纹状或整齐，气生菌丝绒状至棉絮状（图1A2）；菌丝分枝少，有隔膜（图1B2）。大型分生孢子细镰刀状，背腹弯曲，4～6隔，多5隔，有明显的足状基细胞和逐渐变细的顶端细胞，(32.0～67.0) μm × (3.5～8.5) μm（图1C2）。

菌株GZAX 211（苏拉威镰刀菌）7 d菌落直径85 mm，菌落圆形规则，菌丝放射性生长，中间菌丝呈棉絮状（图1A3）；菌丝分枝多，有隔膜（图1B3）。大型分生孢子呈纺锤形，2～6隔，多5隔，(23.0～93.0) μm × (4.0～11.5) μm（图1C3）。

菌株GZAX 408（柑橘镰刀菌）7 d菌落直径58 mm，白色菌落圆形规则，菌丝呈棉絮状至绒状，（图1A4）；菌丝细，有分枝和隔膜（图1B4）。大型分生孢子呈镰刀或纺锤形，2～7隔，多5隔；(23.5～93.0) μm × (4.5～11.5) μm。小型分生孢子椭圆至卵圆形，量极少（图1C4）。

注：A1～A6，菌株GZAX 501、GZAX 207、GZAX 211、GZAX 408、GZAX 106、GZAX 212在PDA培养基上的菌落特征（左正面，右反面）；B1～B6，PDA培养基上的菌丝形态；C1～C6，CLA培养基上的孢子形态；相应菌株在烟草叶部（D1～D6、E1～E6）、茎部（F1～F6）、根部（G1～G6）上的致病力。

菌株GZAX 106（尖孢镰刀菌）7 d菌落直径87 mm，菌落呈圆形，白色菌丝体较致密呈絮状，在琼脂中产生深品红色色素（图1A5）；菌丝分枝多，有隔膜（图1B5）。大型分生孢子几乎笔直，以3隔为主，(30.5～68.5) μm × (4.5～10.0) μm。

菌株GZAX 212（共享镰刀菌）7 d菌落直径78 mm，菌落呈近圆形，边缘波纹状，菌丝茂盛呈絮状至绒状，2～3 d时菌落在PDA上呈粉色（图1A6）；菌丝分枝多，有隔膜（图1B6）。大型分生孢子呈细镰刀状或纺锤形，多3隔，有明显的足状基细胞和逐渐变细的顶端细胞，(27.0～95.5) μm × (4.5～9.0) μm；小型分生孢子椭圆至卵圆形，无隔膜，(4.5～11.5) μm × (1.5～6.5) μm（图1C6）。

根据ITS、联合构建的系统发育树结果表明（图2），菌株GZAX 501、GZAX 207、GZAX 211、GZAX 408、GZAX 106、GZAX 212分别与.、.、.、.、.、.聚于同一最小分支。

2.3 条纹孢壳属病原菌分类鉴定

扩增条纹孢壳属病原菌的片段，获得序列有效长度为545～551 bp的序列，在NCBI上进行同源性比对，结果表明分离得到的条纹孢壳属病原菌为（同源性为100%）。选取菌株GZAX 110进行系统的形态特征描述、系统发育分析和致病力测定。

菌株GZAX 110 生长7 d菌落直径90 mm，菌丝茂盛呈棉絮状，菌丝体为灰色，后加深至灰黑色（图3B）；菌丝分枝少，有隔膜（图3C）。分生孢子为卵圆形或椭球形，部分两端圆钝、中间略向内凹陷，部分一端逐渐变细、另一端圆钝，（21.0～56.5）μm × （13.0～30.0） μm（图3D）。根据基因位点构建的系统发育树结果和形态学特征分析表明，菌株GZAX 110与位于同一最小分支（图3A-D）。

2.4 根霉属病原菌分类鉴定

扩增根霉属病原菌的ITS片段，获得序列有效长度为630～643 bp，NCBI同源性比对（同源性为100%）结果表明根霉属病原菌为小孢根霉（.）。选取菌株GZAX 112进行系统的形态特征描述、系统发育分析和致病力测定。

菌株GZAX 112的气生菌丝为白色蓬松（图4B）；无隔菌丝，具有分枝（图4C）。分生孢子近球形，(5.5～11.0) μm × (3.5～8.0) μm（图4D）。系统发育分析和形态学特征结果表明，菌株GZAX 112为小孢根霉（图4A-D）。

图2 基于镰刀菌属病原菌EF1-α、RPB2序列构建的系统发育树

注：A，基于条纹孢壳属病原菌EF1-α序列构建的系统发育树；B，PDA培养基上培养7 天的菌落特征（左正面，右反面）；C，PDA培养基上的菌丝形态；D，PCA培养基上的孢子形态；菌株GZAX 110在烟草根部（E）、叶部（F-G）、茎部（H）上的致病力。

注：A，基于根霉属病原菌ITS序列构建的系统发育树；B，PDA培养基上培养7 天的菌落特征（左正面，右反面）；C，PDA培养基上的菌丝形态；D，PCA培养基上的孢子形态；菌株GZAX 112在烟草根部（E）、叶部（F-G）、茎部（H）上的致病力。

2.5 枝孢属病原菌分类鉴定

扩增枝孢属病原菌的ITS和片段，得到的序列有效长度分别为468～475 bp、228～231 bp，NCBI同源性比对（同源性分别为100%，98.70%）结果表明枝孢属病原菌为枝状枝孢菌（.）。选取菌株GZAX 113进行系统的形态特征观察、系统发育分析和致病力测定。

菌株GZAX 113生长7 d菌落直径37 mm，菌落形态圆形，边缘整齐，菌丝体匍匐生长，颜色为草绿色，边缘为黄色（图5B）；菌丝具有隔膜和分枝（图5C）。分生孢子多椭球形，两端略尖，少数肾形，(5.5～26.0) μm × (3.5～7.5) μm（图5D）。ITS、联合构建的系统发育树和形态学特征结果表明，菌株GZAX 113为枝状枝孢菌（图5A-D）。

注：A，基于枝孢属病原菌ITS、ACT序列构建的系统发育树；B，PDA培养基上培养7天的菌落特征（左反面，右正面）；C，PDA培养基上的菌丝形态；D，PCA培养基上的孢子形态；E-H，菌株GZAX 113在烟草根部（E）、叶部（F-G）、茎部（H）上的致病力。

2.6 病原真菌的分离情况与致病力

分离得到的病原菌中接骨木镰刀菌有19株，占比29.7%；番薯镰刀菌有1株，占比1.56%；苏拉威镰刀菌6株，占比9.4%；柑橘镰刀菌6株，占比9.4%；尖孢镰刀菌17株，占比26.6%；共享镰刀菌8株，占比12.5%；条纹孢壳属2株，占比3.1%；小孢根霉3株，占比4.7%；枝状枝孢菌2株，占比3.1%。四联村的致病病原菌是接骨木镰刀菌（占比15.6%）、苏拉威镰刀菌（18.8%）、柑橘镰刀菌（18.8%）、尖孢镰刀菌（31.3%）、小孢根霉（9.4%）和枝状枝孢菌（6.25%）；熊坪村的是接骨木镰刀菌（25%）、番薯镰刀菌（6.25%）、尖孢镰刀菌（31.25%）、共享镰刀菌（25%）和条纹孢壳属（12.5%），东礼村的是尖孢镰刀菌（33.3%）和共享镰刀菌（66.7%）。

菌株对叶部的致病力试验表明，菌株GZAX 501（接骨木镰刀菌）、GZAX 106（尖孢镰刀菌）、GZAX 212（共享镰刀菌）、GZAX 110（条纹孢壳属）致病力较强（图1D1、D5、D6，图3F），最强的是GZAX 106（尖孢镰刀菌），菌株GZAX 110（条纹孢壳属）不仅可在叶部形成灰黑色病斑，病斑周围形成黄褐色的晕圈，而且叶部黄化严重。菌株GZAX 207（番薯镰刀菌）、菌株GZAX 211（苏拉威镰刀菌）、GZAX 408（柑橘镰刀菌）、GZAX 112（小孢根霉）、GZAX 113（枝状枝孢菌）致病力较弱（图1D2、D3、D4，图4F，图5F），不会形成深褐色病斑，但会致使叶部黄化萎蔫。对照未发病。

菌株对茎部的致病力试验表明，接骨木镰刀菌、条纹孢壳属致病力最强（图1F1，图3H），茎部在接种菌块后会整株死亡。番薯镰刀菌、苏拉威镰刀菌、柑橘镰刀菌、枝状枝孢菌的致病力较弱（图1F2、F3、F4，图5H），只产生较小的病斑。菌株尖孢镰刀菌、柑橘镰刀菌、小孢根霉致病力最弱，接种后对茎部几乎不产生影响（图1F5、F4，图4H）。对照未发病。

菌株对根部致病力试验表明，苏拉威镰刀菌、柑橘镰刀菌、尖孢镰刀菌、条纹孢壳属致病力较强（图1 G3、G4、G5，图3E），接骨木镰刀菌、枝状枝孢菌的致病力较弱（图1G1、图5E），番薯镰刀菌、共享镰刀菌、小孢根霉的致病力最弱（图1G2、G6，图4E），接种病原菌后病株叶部发现不同程度的萎蔫黄化，须根减少。对照未发病。

综上，统计了各菌株对叶部、茎部和根部的致病力（表1），发现菌株对叶部和茎部的致病力相似，但共享镰刀菌对叶部致病力强，而对茎部致病力较弱（图2D6、E6、F6）。烟草叶部和茎部在划伤和未划伤情况下致病力略有差异，划伤致病力普遍强一些。

表1 病原菌的致病力分析

注：“+++”表示致病力强，病斑面积大于30 mm；“++”表示致病力较强，病斑面积10～30 mm；“+”表示致病力弱，病斑面积小于10 mm。

Note: “+++” indicates strong pathogenicity and the diameter of lesion is greater than 30 mm; “++” indicates that moderate pathogenicity and the diameter is 10-30 mm; "+" indicates weak pathogenicity and the diameter is less than 10 mm.

3 讨 论

镰刀菌属（sp.）真菌是引起植物根腐病的主要致病菌，其种类繁多，地理分布广[21]。其中尖孢镰刀菌（.）是引发烟草镰刀菌根腐病的优势病原菌群，会导致叶部发黄萎蔫下垂、枯死[2,22]。陈高航[22]发现接骨木镰刀菌（.）是烟草根腐病的非致病菌。吴安忠等[23]报道共享镰刀菌（.）为烟草根腐病的主要病原物。本研究结果表明尖孢镰刀菌和共享镰刀菌对叶部致病力较强，这与前人研究结果一致；但本研究分离得到的接骨木镰刀菌对叶部及茎部致病力都较强，与陈高航[22]的研究结果不一致，说明该菌可能存在致病力分化，需要进一步研究。在前人研究中并未出现番薯镰刀菌（.）、苏拉威镰刀菌（.）和柑橘镰刀菌（.），本研究发现番薯镰刀菌、苏拉威镰刀菌和柑橘镰刀菌致病力较轻，可见其不是主要病原菌。本研究分离得到的优势真菌属为镰刀菌属，而镰刀菌属（sp.）真菌是引起植物根腐病的主要致病菌[23]，因此在烟草生产中需把根腐镰刀菌作为防治对象。

李小林[24]发现根霉属是成熟期烟草根际优势真菌之一；刘宏玉等[25]在分离烟草根、茎和叶内生真菌种类组成时发现，枝孢属在根茎叶均有分布；但目前并不清楚根霉属与枝孢属在烟草上的致病力强弱。条纹孢壳属并未在以往的研究结果中出现。本研究发现条纹孢壳属对烟草致病力强，在致病力检测时，其他菌株均未导致烟草叶部黄化，但.不仅使叶部产生褐色病斑，并且使整个叶部黄化。本研究还发现菌株的种类和采样地点也有一定关系，尖孢镰刀菌在四联村、熊坪村和东礼村的田间发病植株中分离得到，故该菌株不存在地理隔离，在三地普遍引发病害；番薯镰刀菌和条纹孢壳属仅在熊坪村的病株中分离得到，苏拉威镰刀菌、小孢根霉和枝状枝孢菌仅在四联村分离得到，这5株病原菌有地理特异性，推测可能存在地理隔离。有研究表明镰刀真菌在复合侵染中具有重要的地位与优势，2种以上病原菌混合接种植株致病力效果比单独一种侵染发病率高、致病力强，潜育期短[26]。在本研究中，接骨木镰刀菌，尖孢镰刀菌，共享镰刀菌和条纹孢壳属是烟草根腐病的主要病原真菌。但环境条件导致地域间病害种类及其发生情况不同，因此，为了更符合烟草生产的实际情况，本研究分离得到的多种菌株复合侵染对病原真菌致病力的强弱、侵染速度的快慢及不同条件对不同菌种侵染情况的影响等问题还需进一步研究。

4 结 论

形态特征、分子鉴定和致病力分析表明，发病植株根茎部分离得到的64株病原菌，包括镰刀菌属6种，条纹孢壳属、根霉属和枝孢属各1种，镰刀菌属是优势菌群。接骨木镰刀菌和条纹孢壳属病原致病力较强。首次从烟草上分离到番薯镰刀菌、苏拉威镰刀菌和柑橘镰刀菌，致病力较轻，为次要病原菌。在防治根茎部病害时把镰刀菌属作为重点防控对象。同时也需监测条纹孢壳属、根霉属和枝孢属的发生与流行情况，对有效控制烟区病害的发生具有重要作用。

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Isolation and Identification of Pathogenic Fungi from the Rhizomes of Tobacco

LIU Xi1,2, LI Yiting1, CAI Liuti2, ZHANG Changqing1, YIN Junliang1*, WANG Hancheng2*

(1. College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China; 2. Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China)

In order to systematically understand the main pathogenic fungi in the rhizosphere of tobacco, diseased rhizosphere samples were collected from three tobacco planting areas. Then pathogen isolation and identification were performed in the laboratory, and 64 strains of pathogenic fungi were obtained. According to the morphological characteristics of colonies, mycelium, and spores, as well as the phylogenetic analysis of multiple gene loci, the strains were identified at the species level; and their pathogenicity were tested in leaf, stem, and root of tobacco. The results showed that the isolated pathogens included,.,....,,, and. Pathogenicity assays indicated that these pathogens had certain pathogenicity to tobacco. The pathogenicity of,andwere strong. The pathogenicity of.,..,.and.were weak. The classification and identification results of the pathogenic fungi will provide a foundation for the scientific, reasonable, and effective control of tobacco rhizosphere diseases.

root and stem diseases;sp.;sp.;sp.;sp.

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.007

S435.72

A

1007-5119（2022）06-0045-08

中国烟草总公司贵州省公司科技项目（201914、2020XM03）；中国烟草总公司科技项目[110202101048（LS-08）、110202001035（LS-04）]；贵州省“百层次”创新型人才项目{黔科合平台人才-GCC[2022]028-1}

刘 茜（1998-），女，主要从事烟草病原真菌学研究。E- mail：1419650896@qq.com

，E-mail：尹军良，yinjunliang@yangtzeu.edn.cn；汪汉成，xiaobaiyang126@hotmail.com

2022-03-29

2022-10-05