鱼类生长分子标记的研究进展

李文文，王炳谦，黄天晴，谷伟，刘恩慧，刘洋，姜再胜，徐革锋

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，农业农村部淡水鱼生物技术与养殖重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150010；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 200120；3.安徽省宣城水产技术推广站，安徽 宣城 201306）

鱼类是重要的经济生物，为人们生活提供优质的动物蛋白。提高养殖鱼的生长性能、优化生长性状不仅可以缩短养殖时间、节约养殖成本，还能增加产量，满足人们的食物需求。鱼类的生长性状是多因素调控的复杂性状，不仅受环境因素影响，还受生长性状相关基因的决定。近年来分子标记技术的发展为优化鱼类生长提供了理论基础和技术支持。

1 分子标记技术的原理和主要方法

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记后兴起的一种新的遗传标记形式[1,2]。常说的分子标记是指狭义的分子标记，即DNA 序列标记[3]。自中心法则发现以来，核酸、蛋白质等生物大分子在决定生物性状上扮演着重要角色，分子标记作为深入了解遗传学的重要工具，与下一代测序技术结合，极大地丰富了育种策略[4]。随分子生物学的发展，分子标记技术也不断更新，迄今为止已经历三次革新，第一代分子标记技术包括限制性长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技术、随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术、扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术；第二代分子标记包括简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSR）标记和内部简单重复序列（Inter-simple sequence repeat，ISSR）标记；第三代分子标记包括单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）标记和表达序列标签（Expressed Sequence Tags，EST）标记[2]。

1.1 第一代分子标记技术

1.1.1 RFLP 标记技术

1980 年Botesin 最早将RFLP 用作DNA 遗传标记，通过检测酶切后同源DNA 片段长度的差异反映DNA 分子的微小变化，不受环境影响，呈孟德尔共显性遗传，可区分纯合和杂合基因型，稳定性高，重复性好；然而，其只能酶切特定的位点表现其多态性，灵敏度不高，限制了RFLP 技术的应用[2,5,6]。

近年来，RFLP 标记技术与PCR、电泳技术完美结合[5]；通过连锁标记定位目的基因，在水产生物遗传育种中发挥着重要作用。利用RFLP 标记，张四明等[7]研究长江中游的鲢（Hypophthalmichthys molitrix）和草鱼（Ctenopharyngodon idella）mtDNA 的遗传结构变异；董传举等[8]对鲟（Acipenser sinensis）线粒体进行PCR-RFLP 以区分混合池的不同养殖对象。

1.1.2 RAPD 标记技术

RAPD 标记是基于PCR 技术、利用随机短脱氧核苷酸单链为引物，扩增后的DNA 片段经电泳分离、染色后检测其多态性[5]。RAPD 拥有PCR 技术的所有优点，能够大量筛选出基因位点，常被用于鱼类的遗传育种、种质鉴定、种群结构分析、遗传多样性分析、疾病治疗等[9]。该技术操作便捷、安全性好，弥补了RFLP 的不足，但RAPD 表现为孟德尔显性遗传，不能识别杂合位点，实验重复性较差[2]。

Ebtsam 等[10]从克氏原螯虾（Procambarus clarkii）体内分离出株丝孢菌并对毒力因子进行RAPD 检测，证实了该种真菌对小龙虾的致病性，进而感染其他生物，对微生物疾病防治起到一定的指导意义；Yao 等[11]通过PCR-RAPD 扩增金枪鱼（Thunnini）Cyt-b 基因，用于区分制作刺身的金枪鱼种与误用种黄鳍金枪鱼（Thunnus albacores）、蓝鳍金枪鱼（Thunnus thynnus）、大眼金枪鱼（Thunnus obesus）、大西洋蓝鳍金枪鱼（Thunnus thynnus）和长鳍金枪鱼（Thunnus alalunga）、鲣（Katsuwonus pelamis）、条纹四鳍旗鱼（Tetrapturus audax），及剑鱼（Xiphias gladius）的遗传差异。

1.1.3 AFLP 标记技术

AFLP 是近些年兴起的基于PCR 技术的多位点标记技术，在PCR 引物的3’端添加碱基，延伸过连接位点并进入DNA 片段，引物序列正确时进行退火[9]。少量的引物就可以检测出大量位点，成本较低，遗传稳定性好，多态性丰富，为水产动物的亲缘关系鉴定、多态性位点分析、遗传多样性、基因的表达与调控等研究提供了行之有效的方法[2,5]。

利用AFLP 标记技术，袁文华[5]对不同多鳞（Sillago sihama）群体进行遗传多样性分析并构建遗传图谱，为其人工育种提供合理的指导策略；Felip等[12]利用486 对引物在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）Y 染色体上鉴定出11 个性别相关标记，为进一步分析性别基因座提供了实验基础。

1.2 第二代分子标记技术

1.2.1 SSR 标记技术

SSR 是由几个（通常为2～6 个）核苷酸为单位组成的串联重复序列，常见的为双核苷酸重复（CA）n和（AT）n[2,9,13]。SSR 可以作为RFLP 的探针，为孟德尔共显性遗传，一个DNA 芯片可以同时检测出基因组中的多个变异位点，遗传方式简单、DNA 用量少、检测迅速，具有丰富的多态性，已被广泛用于各类物种基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘关系分析及品种鉴定、遗传育种以及进化等研究[2,13]。

Han 等[14]在梭鲈（Sander lucioperca）转录组共检测到16 368 个SSR，随机选择300 个进行扩增，检测成功率高达87%，为梭鲈转录组学研究奠定基础；Henry 等[13]在超级雌性半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）中鉴定出206 bp DNA 条带，证明了半滑舌鳎ZW 性别决定机制，为全雌鱼繁育提供了重要的依据。

1.2.2 ISSR 标记技术

ISSR 是在SSR 的3'或5'端加上2～4 个核苷酸作为引物，对间隔重复序列进行扩增的新兴标记技术[2]。与SSR 相比，ISSR 无需知道基因组序列，设备简单、重复性好、灵敏度高，常被用来评估群体遗传变异[15]。

Liu 等[16]利用12 个不同的ISSR 引物对牙鲆（Paralichthys olivaceus）3 个群体筛选，发现与普通群体相比，感病和抗性群体存在明显的遗传差异，对牙鲆资源的保护具有深远的意义；Saad 等[17]鉴别四种罗非鱼时发现奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）和吉利慈鲷（Tilapia zillii）遗传差异最大，而尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）和奥利亚罗非鱼的遗传差异最小。ISSR 为物种鉴定提供了有力的工具。

1.3 第三代分子标记技术

1.3.1 SNP 标记技术

SNP 是最新型的遗传标记技术，由单个核苷酸变化（包括替换、颠换、缺失和插入）引起的DNA 序列多态性，是遗传变异中最常见的一种[2,13]；在基因组中的分布广泛，在调控蛋白质功能、基因定位、生物性状的关联分析、群体遗传系统发育分析与个体鉴定等领域应用前景极为广泛。

Zhang 等[18]在7 种鲑科鱼类（哲罗鲑、樱鲑Oncorhynchus masou、美洲红点鲑Salvelinus fontinalis、细鳞鲑Brachymystax lenok、白点鲑Salvelinus pluvius Hilgendorf、银鲑silver salmon、虹鳟）检测出虹鳟的SNP 多态性最高；Xu 等[19]在鲤（Cyprinus carpio）基因组中成功开发250K SNPs 用于基因分型，对鲤及相关物种的遗传和种群研究具有深远的意义。

1.3.2 EST 标记技术

EST 是作为遗传标记应用与连锁分析而发展起来的一项新的标记方法，最初应用于人类基因组的研究，进而应用于植物、动物等基因组的研究[2,13]。ESTs 对特定组织、特定时期表达的基因进行初步观察。EST 常与其他标记技术结合用于水产养殖，有利于水产养殖物种的基因定位[9]。

蓝身大斑石斑鱼（Epinephelus tukula）是新兴的经济养殖鱼类，生长速度快，Hsu 等[20]建立了基于转录组信息的EST 和SSR、SNP 结合技术，得到了与生长相关的多态性位点，可用于蓝身大斑石斑鱼MAS 和基因多样性研究；RADONIĈ 等[21]开发了一套EST-SSR 标记监测蓝鳍金枪鱼养殖周期中的基因，对现有的EST-SSRs 资源进行补充，为石斑鱼养殖中基因水平上的研究提供了技术支持。

2 分子标记在鱼类生长相关性状中的研究进展

生物生长是复杂的数量性状和重要的经济目标，受多个基因共同调控[22]，其基因在染色体上的位置称为数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）。利用分子标记等遗传学方法对生长性状相关基因进行连锁定位分析[23,24]，进而对QTLs 进行定位和遗传分析是选择性育种的基础。

2.1 鱼类生长相关基因

鱼类生长相关基因包括主基因和候选基因，主基因与表型性状高度相关，但生理功能不确定；候选基因是生理功能确定并直接影响生长性状的表达，在染色体上与主基因相连，可作为QTL 的标记，深入研究候选基因有助于在水产养殖育种中获得优良性状[25]。

对SNPs 和生长有关的候选基因进行关联分析是最早应用的技术，研究发现生长轴上的和生长调节因子家族中的基因是调节鱼类生长最重要的基因。生长轴上的基因控制生长激素释放激素（GH RH）、生长激素抑制激素（GHH 或生长抑素）、生长激素（GH）、胰岛素样生长因子（IGF-I 和IGF-II）等激素的合成，在调节生理代谢过程中不可或缺。除此之外，生长轴上还含有调控GH 和IGF 合成的胰岛素（insulin）、甲状腺激素（thyroid hormones）、糖皮质激素（thyroid hormones）基因等[22,25]。GH 参与细胞增殖、骨骼生长以及蛋白质合成过程，与组织细胞中的GRH 结合，刺激细胞产生IGF 并进入相应的受体细胞，通过调节糖代谢而调控细胞和机体的生长[22,25]。

对多种鱼类的GH 等生长相关基因的SNP 分析发现，在外显子、内含子、3’调控区、5’调控区上均含有与生长性状显著相关的SNPs 位点[25]，且草鱼（Ctenopharyngodon idella）和鲤的GH 序列高度同源，虹鳟和大西洋鲑（Salmo salar）的GH 序列同源，而草鱼和鲑鳟仅在少数外显子中观察到同源性[26]。除对少数已知生长相关基因进行SNPs 筛选外，还有大量生长相关候选基因有待研究。通过对硬骨鱼类全基因组进行关联分析，陆续在鲫（Carassius auratus auratus）[27]、斑点叉尾（Ictalurus Punetaus）[28]等鱼类中发现了新的与体质量、体长等相关的SNP 位点。新的分子标记的成功筛选与定位对水产养殖分子辅助育种的发展具有重要意义。

2.2 分子标记辅助育种在鱼类生长中的筛选与鉴定

选择育种将生物表型作为育种目标，选择性状优良的个体杂交并在多代内定向选择，提高优势基因频率，获得符合人们预期的基因型或表型，使优良性状稳定遗传，最终获得新品系（品种）。近年来基因组学、分子生物学和现代遗传学快速发展带动了遗传连锁图谱构建、QTL 定位和分子标记辅助育种技术的进步。

传统的育种方法对数量性状的选择效果并不明显，标记辅助育种（Marker assisted selection，MAS）利用与性状相关基因连锁的分子标记选择复杂的数量基因座，是对数量性状候选基因进行选择的有效方法[29]。

2.2.1 表型性状

鱼类生长速度是评价养殖产品质量的重要指标，也是选育的重要性状之一，生长速度决定了养殖的生产速率和周期[29]，直接影响养殖业的经济效益，提高养殖鱼的生长速度是增加水产养殖业经济效益的关键。

从19 世纪90 年代开始进行鲤生长性状相关的分子标记筛选，至今已鉴定的QTL 达上千个。中国水产科学研究院黑龙江水产研究所梁利群课题组一直致力于鲤的研究，对大头鲤和荷包红鲤抗寒品系杂交F2代进行遗传连锁分析，鉴定出7 个与体长性状显著相关的SSR 多态性位点[30]；随后利用265 个AFLP 标记、127 个SSR 标记、37 个EST-SSR标记和16 个RAPD 标记成功构建鲤遗传连锁图谱[31,32]，并定位到6 个与体质量、体长、体高显著相关，8 个与体长、体高、体厚相关的QTL 位点[33,34]。

除鲤之外，大西洋鲑也是较早进行遗传研究的经济价值较高的鱼类[35]。DP Reid 等[36]定位到了8个与体质量相关的SSR 位点；随后，Gutierrez 等[37]对5 个品种的大西洋鲑亲本进行SSR 基因分型后，利用6.5 K SNP 标记技术筛选出6 个基因连锁群上与体质量相关的主基因和候选基因QTL 区间。

在草鱼MyoD 基因[38]中检测出4 个多态性高、分型稳定的突变位点，利用SNP 和Indel 标记分型得到2 个分别与体长、全长、尾柄长、尾柄高和体质量、体宽、体高、眼间距显著相关的突变位点，GHRH基因[39]上筛选得到4 个与生长存在显著相关性的SNPs 位点，在载脂蛋白A-I-1（apoA-I-1）基因的非编码区筛选得到2 个与体质量、体长、体高、头长高度关联的SNPs 位点，为草鱼分子辅助育种提供了候选标记，为加快草鱼育种进程奠定了基础。

牛余泽等[37]用221 个SSR 标记构建牙鲆的遗传连锁图谱并对数量性状QTL 定位，得到4 个与生长显著相关的SSR 位点；SUN 等[40]首次构建黑尾近红鲌（Ancherythroculter nigrocauda）高密度遗传图谱，包含5 901 个SNPs 位点；Ali 等[41]在虹鳟体内鉴定出247 个与体质量增加相关的SNPs 位点，在编码血栓反应蛋白-1（THBS1）基因中突变位点多态性最高。

2.2.2 肌肉品质

肌肉生长主要受到肌肉组织产生的肌源性调节因子（MRFs）和肌肉生长抑制素因子（MSTN）的调节。MRFs家族包括myogenin、MyoD、myf-5 和myf-6，仅在脊椎动物的骨骼肌中表达，参与肌肉生成；MSTN 属于转化生长因子β（TGF-β）家族，对肌肉的生长发育进行负调控[25]；鱼类肌肉中还含有丰富的小清蛋白基因（PVALB1 和PVALB2），编码的小清蛋白能够调节肌肉纤维松弛度。SNPs 结果显示：PVALB1 基因与幼鱼体质量和体长性状密切相关[42]；生长轴上GH 与GHR 结合能够促进肌肉生长，IGF 及其受体对肌肉生长也起到调节作用。

Derayat 等[43]利用AFLP 和SSR 标记在大西洋鲑中筛选出一个与脂肪含量密切相关的QTL 位点；Baranski 等[44]在128 个与肉色相关的SSR 位点进行基因分型，得到32 个与肉质相关的多态性位点，为大西洋鲑鱼肉质和生长候选基因的研究和遗传育种提供了有力证据；毛瑞鑫等[45]在编码乳酸脱氢酶（LDH）基因中定位到12 个SSR 位点；徐磊等[46]在大口黑鲈（Micropterus salmoides）新品种的选育过程中发现，IGF-I 基因上SNP 位点的生长优势基因型随选育代数累加。

2.2.3 抗逆性

抗逆性直接影响养殖鱼的存活率和经济效益。为提高养殖鱼的产量和经济价值，疾病、水资源环境对鱼类生长提出了极大的挑战，目前已在虹鳟、草鱼、鲤等经济鱼类中广泛开展了抗逆性研究。

低氧是水产养殖动物面临的主要胁迫之一，严重影响鱼类生长。利用cDNA-AFLP 确定鳙低氧反应中相关差异基因，揭示了鳙在低氧逆境中的生理和遗传调控机制[47]。团头鲂（Megalobrama amblycephala）对水体溶氧的变化极为敏感，低氧耐受能力显著影响表型性状。基于高通量测序开发低氧相关SNP 标记[48]，Egln2 基因上的2 个完全连锁的多态SNP 位点与耐低氧性状密切相关，可作为团头鲂耐低氧新品系的分子特征标记[49]；

Perry 等[50,51]对虹鳟耐高温性状进行了SSR 研究，发现Ssa20.19NUIG 耐热显著关联；抗传染性造血坏死（infection hematopoietic necrosis，IHN）是虹鳟的高传染性疾病，严重影响虹鳟各个生长时期的健康。Rodriguez 等[52]对虹鳟的回交品系DNA 提取物进行AFLP-RCR 后用SSR 标记进行IHN 定位，结果显示：6 个AFLP 和6 个SSR 标记位于雌性遗传图谱的6 个连锁群，16 个AFLP 和6 个SSR 定位于雄性遗传图谱的3 个连锁群，IHN 的定位对虹鳟抗病育种具有重要参考价值；除虹鳟外，孙俊龙[53]在草鱼LEAP-2 基因上发现2 个与抗病性显著相关的SNP 位点（Site01 和Site02）。

3 展望

水产生物研究的最终目的是定位经济性状的基因座以用于培育优质新品种，提高水产养殖业的经济效益和生态效益[54]。水产品为人们生活贡献了15%以上的动物蛋白[55]，以人类基因组研究为基础，已完成对多种模式生物的基因组研究。早期利用一代图谱就已经对多种生物的QTL 进行了众多研究，利用分子标记技术建立物理图谱、高密度遗传图谱、性状连锁分析等。随生物学发展二代测序技术的应用逐渐广泛，与一代测序技术相比，二代测序技术不仅节省了测序成本，还保证了准确率，提高了测序效率，极大地推动了基因组学的发展[56]。

水产养殖产品的生长性能和品质性状是复杂的数量性状，基因与性状的关系及其复杂，利用多种组学方式研究探索性状是近代生物发展的主要趋势。将分子标记技术和新一代测序技术、基因组学结合，利用分子标记技术对QTL 区间进行定位，筛选并鉴定目标性状，选育出生长状况良好、抗逆性强的新品种并稳定遗传。数量性状同时受主基因和候选基因的调控，但主基因和候选基因在不同的群中遗传效应不同，一些QTL 与主基因连锁并不紧密，现如今对候选基因的研究并不彻底，在基因组中QTL 的定位并不准确，遗传距离较大，在今后实验中还需要加大对QTL 精准定位的研究，准确定位目的基因位点从而筛选关键基因；另外利用多种组学结合方式研究已广泛运用于人以及多种模式生物，但在水产生物上的研究应用还比较少，将分子标记技术与多组学研究结合加快水产生物的育种进程是未来的研究趋势[54]。