石山口水库水体微生物多样性研究

林伟，赵良杰，杨治国

（信阳农林学院水产学院，河南 信阳 464000）

石山口水库坐落于河南省信阳市东南地区，水库最大容量为3.7×109m3，流域面积约306 km2，是以灌溉为主，保证防洪、结合发电、以及养殖的丘陵型水库。水源以灵山冲河道水为主，年平均径流量1.392×109m3，年输出水量0.8×109m3，年平均降水量约为1 120 mm。水库岸线曲折，支流众多，沿库有6 个乡、36 个行政村的农田、山林。库区周围土地利用以茶园、林地、耕地、居民用地为主[1]。石山口水库水体平均深度在9.3 m 左右，利于滤食性鱼类花鲢（Aristichthys nobilis）、白 鲢（Hypophthalmichthys molitrix）生长。石山口水库被私人承包多年，以前有肥水养鱼的情况，水体富营养化比较严重。近年来，城市化和工业化的飞速发展，人类活动、农业、重工业等产生的垃圾，使得各地的河流、水库等均受到了不同程度的污染，有机物富集并滋生大量微生物。微生物是湖泊水生态系统中的初级生产者，一般个体小、数量多、繁殖速度快、分布范围广等，在水体有机质的分解、污染物降解、生态系统修复方面均具有重要的作用。微生物对水体环境因素的变化极其敏感，所以微生物的群落组成与多样性常常被用来反映水环境的变化。因此微生物数量、组成、多样性等指标常被用作评价水质的重要生物指标。

微生物可以作为环境现状指示生物，还可以反过来影响外界水环境，修复河流水体生态，因此，研究微生物群落结构特征具有重要意义[2]。研究微生物多样性的传统方法主要是分离培养方法。该方法研究时间长，很多微生物没有有效的培养方法，无法进行系统研究。宏基因组测序技术已极为成熟，可以快速分析样品中所有微生物的种类及丰度。采用宏基因组方法研究石山口水库水体微生物多样性，为确定石山口水库水质的优劣，对水体的治理和渔业养殖模式提供了一系列的数据支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域与样品采集

根据《水质采样方案设计技术规定》的断面设置原则，在石山口水库的上、中、下游选取流急、适中和缓慢处设三个采样区，7 个样品点（图1）；在水库两支流处分别设置1#和2#两个采样点，坝前设置3#采样点。2017 年5 月中旬采样，1#、2#采样点深度均为0 m、3 m，分别记作ssk1.0 m、ssk1.3 m、ssk2.0 m、ssk2.3 m，3#采样点深度分别为0 m、4 m 和8 m，分别记作ssk3.0 m、ssk3.4 m、ssk3.8 m，共计7 个水样。

图1 石山口水库采样点分布Fig.1 Distribution of water sampling sites in Shishankou

1.2 方法

通过Illumina 平台对样品进行高通量测序，实验流程分为：基因组DNA 的抽提、PCR 扩增、荧光定量、构建Miseq 文库和Miseq 测序[3]。

1.2.1 基因组DNA 的抽提

采用Power Soil DNA Kit（Mo Bio Laboratories，Carlsbad，California，美国）提取样品中的总DNA。量取一定量的水体样品，按照说明书进行DNA 提取，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取到的总DNA，并核对基因组DNA 的浓度与完整性[4]。

1.2.2 PCR 产物扩增

以提取水样的总DNA 为模板，采用细菌通用引物：正向27F:（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和反向引物1492R:（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），扩增细菌16S rDNA 序列。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，然后用离心柱型琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR 产物[5]。

1.2.3 荧光定量标记

参照电泳初步定量结果，将PCR 产物通过荧光染料或荧光标记的特异性探针进行检测定量，之后每个样品按照特定的测序量要求进行相应比例的混合。

1.2.4 构建Miseq 文库

对上面经过荧光定量标记过的样品处理，使样品之间连接成“Y”字形接头；然后通过磁珠筛选，去除接头自连片段；先对筛选后的样品进行PCR 扩增，然后进行Miseq 文库模板的富集；最终由于氢氧化钠变性，产生单链DNA 片段[6]。

1.2.5 Miseq 测序

取一段16S rRNA 基因片段为引物，用PCR 仪对采取的基因片段进行扩增[7]。

按照每个样品的特定测序量要求，检测定量扩增基因，然后根据特定比例混合，对原始序列初步处理，进行OTU 聚类（97%相似性可认定为同一个种，初步认为一个OTU 都是属于一个种的微生物），选取高质量的序列进行分析[8]。

1.3 数据分析

将上面分析出来的数据绘制成Excel 表格，之后分别计算出相应的Chao 指数、ACE 指数、Shannon 指数和Simpson 指数。在以上基础上运用IBM SPSS Statistics 22 软件对这些数据进行物种组成的聚类分析和主成分分析（PCA）等统计比较分析[9]。

（1）ACE 指数：用来估计群落中含有的OTU 数目的指数。

（2）Chao 指数：在生态学中一般用来评估物种的总数。

（3）Shannon 指数：即香农指数，一般用来表示样本的微生物多样性。

H'=-ΣPi1nPi，式中:Pi为物种i 的个体数占总个体数的比例，i=1,2,...,S。

（4）Simpson 指数：即辛普森指数，一般用来表示样本的微生物多样性和均匀度。

D=1-ΣPi2，式中:Pi为物种i 的个体数占总个体数的比例，i=1,2,...,S。

2 结果与分析

2.1 微生物群落多样性指数分析

利用Illumina 公司线上分析平台分析3 个采样点水样中的微生物多样性指数，包括：分类单元数、Chao 指数、ACE 指数、香农指数（Shannon index）和辛普森指数（Simpson index）等[10]（表1，图2～图4）。水体中分类单元数介于547～666 之间，Chao 指数介于615.4789～731.6557，ACE指数介于614.5390～726.0438，说明样品丰度较大。香农指数介于5.018～5.167 之间，说明样品的多样性较高，物种丰富。辛普森指数介于0.0119～0.0191 之间，说明样品的均匀度较差。

表1 石山口水库水中微生物多样性指数分析Tab.1 Analysis of microbial diversity indices in water in Shishankou Reservoir

图2 石山口水库微生物分类单元数、Chao 指数、ACE 指数分析Fig.2 Analysis of the number of microbial taxa,Chao index and ACE index in Shishankou Reservoir

图3 石山口水库微生物Shannon 指数分析Fig.3 Analysis of microbial Shannon index of in Shishankou Reservoir

图4 石山口水库微生物Simpson 指数分析Fig.4 Analysis of microbial Simpson index in Shishankou Reservoir

2.2 微生物群落组成

由图5 可知，石山口水库水中有50%～70%左右未被鉴定出来的微生物种群，在已知的微生物种群中优势种有：念珠菌（Candidatus-Pelagibacter,12.10%～17.50%）、硫单胞菌属（Thiomonas,0.69%～1.21%）、军团杆菌属（Legionella,0.55%～0.87%）、拟杆菌门（Terrimonas,0.42%～0.93%）、杆菌（Paucimonas,0.50%～0.83%）、多核杆菌属（Polynucleobacter,0.35%～0.61%）、发光杆菌属（Ilumatobacter 0.25%～0.51%）、甲基单胞菌属（Methylocystis,0.21%～0.35%）、黄杆菌属（Flavobacterium,0.13%～0.24%）、分枝杆菌属（Sediminibacterium,0.08%～0.16%）、微小杆菌属（Exiguobacterium,0.00%～0.62%）等。

图5 石山口水库水体中主要优势菌门群落结构组成Fig.5 The main bacterial dominant community structure composition in waters of Shishankou Reservoir at phylum level

2.3 微生物群落的空间分布

聚类树状图（图6）直接显示了石山口水库水体7 个样品间微生物群落多样性的相似性。1#采样点的0 m 处与其他采样点差异较大。2#采样点的0 m、3 m 处归聚为一类，说明这两处采样点微生物群落组成结构较为相似。3#采样点的0 m、4 m 处归聚为一类，说明这两处微生物群落组成结构较为相似。1#采样点的3 m 处与3#采样点的8 m 处归聚为一类，微生物群落组成结构较为相似。总之，石山口水库不同层次水体的微生物群落结构组成差异较小。

图6 石山口水库微生物聚类树状图Fig.6 Microbial clustering dendrogram in Shishankou Reservoir

图7 为石山口水库水体微生物PCA 分析，图中的点代表各样品，样品间相似度越低在空间距离上越远，反之，样品间的相似度越高，在图上的距离越近。由图7 可知，1#采样点两处距离较大，即相似度较低。2#、3#采样点的0 m、4 m 处距离较近，即这几处的相似度较高。而3#采样点的8 m 处与其他几处距离都较远，则证明此处与其他几处相似度极低，微生物群落结构差异较大。

图7 石山口水库微生物PCA 分析Fig.7 Microbial PCA analysis in Shishankou Reservoir

3 讨论

3.1 石山口水库不同方位微生物群落结构特征

本研究中，3#采样点8 m 处的Shannon 指数高于其他几个采样点，表明3#采样点8 m 处的微生物群落结构与其他几个采样点差异较大。这可能是水体深度较大，满足厌氧微生物类群的生存环境条件。石山口水库平均水深为9.3 m，而3#采样点的8 m 处距离水库底部较近，有机物沉积在水体底部，致有机物含量较高，故而3#采样点8 m 处的微生物多样性相比于其他采样点更加丰富。石山口水库水体中主要优势菌群落结构组成表明，微生物群落结构组成大都相似。因此石山口水库坝前水体与其他支流处微生物物种组成相似。主成分分析图表明，除了3#采样点水体深度较大，与其他样品距离较大，差异较大，其他采样点距离都较近，微生物群落结构大都也一样。

3.2 不同微生物群落结构对渔业养殖模式的影响

本研究中，大部分优势菌种常见于一些富营养化水体中，说明石山口水库有富营养化趋势。水体中微生物群落结构组成和多样性并不只与水体营养状况有关，水中浮游藻类增多，也会极大影响滤食性鱼类捕食作用。实践表明：在水中适当增加鲢的数量，降低鳙的数量会有利影响水质，使水体浮游动物数量增加，浮游植物数量减少，有效控制水体富营养化，阻止其进一步恶化。

私人承包使石山口水库投放鱼体质量为1.5～2.0 kg 的大规格鲢鳙。鱼规格越大、越成熟，渔业模式就越稳定，水质状况会随着渔业状况而变化，水质又会影响细菌状况。用水体各理化指标检测评价以及水中生物指标检测评价相结合的方法发现，水体富营养化会严重破坏水体微生物群落结构，扰乱微生物群落生态系统的稳定性。

石山口水库属于淮河流域，而南湾水库位于淮河支流浉河上，故而其渔业模式相近。李林春[12]在研究南湾水库时通过调节鲢鳙的放养比例发现，适当增加鲢鳙比例虽然不能完全改变水库的富营养化状态，但却可以使水质得到一定的改善。所以通过调整渔业养殖模式可以在一定程度上改善水体的营养状况。

目前，生态修复水体富营养化的对策很多，但都很难起到可观的成效，所以就极其缺乏一种效果好、价格低廉、又能全面推广的生态治理方法。研究表明，发展一种健康生态养殖模式，应适当增加鲢鳙放养比例，控制凶猛肉食性鱼类，是一种保护水质，实现水库渔业高效可持续发展的一种有效途径[13]。