微小RNA-31-5p调控蛋白激酶Cε通路在远程缺血预处理保护兔脊髓缺血再灌注损伤中的作用机制

秦 洋, 倪锦萍, 康 利, 仲志栋, 王立仁, 尹述洲

(上海交通大学医学院附属苏州九龙医院 麻醉科, 江苏 苏州, 215021)

脊髓缺血再灌注损伤(SCIRI)是脊髓的第2大常见损伤，具有神经功能障碍和瘫痪的风险，严重影响患者的生活质量[1]。缺血预处理对诸多器官的缺血再灌注(I/R)损伤具有保护作用，近年来引起了广泛关注。缺血预处理的保护作用不局限于局部组织，可以转递到远隔组织，该现象被称为远程缺血预处理(RIPC)[2]。报道[3]显示, RIPC可诱导脊髓缺血耐受，减轻SCIRI, 但其相关分子机制尚不明确。

蛋白激酶Cε(PKCε)是PKC家族成员，在脊髓组织中表达丰富，参与多种疼痛调节[4]。目前已证实RIPC可激活心脏组织中PKCε蛋白，从而激活PKC信号通路，进而发挥心脏I/R损伤的保护作用[5]; 并且在SCIRI中, RIPC可能通过激活PKCε蛋白，增加脊髓组织中脑源性神经营养因子(BDNF)表达，从而保护脊髓免受I/R损伤。但RIPC后, PKCε蛋白激活的具体机制尚未阐明。微小RNAs(miRNAs)在SCIRI的发病机制中起着至关重要的作用[6]。研究[7]显示，微小RNA-31-5p(miR-31-5p)的下调与PKC通路的激活有关, miR-31-5p是PKCε的上游调控因子。本研究通过对兔右下肢进行RIPC后，再阻断腹主动脉建立SCIRI模型，以观察miR-31-5p在RIPC防治SCIRI中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

日本大耳白兔60只，雄性, 3～4月龄，体质量2.2～2.5 kg, 购自青岛康大生物科技有限公司，生产许可证为SCXK(鲁)2017-0005。白兔于普通环境饲养，维持在12 h的明暗循环中，健康状况良好。

1.2 试剂及仪器

miR-31-5p mimic及其阴性对照(miR-NC)(上海吉玛制药技术有限公司); 苏木精-伊红(HE)染色试剂、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液和BCA蛋白质浓度测定试剂盒(碧云天生物科技公司，货号: C0105、C1088、P0013B、P0012S); 伊文思蓝(EB)染色液(0.5%, solarbio公司，货号: DK0001); 鼠源一抗PKCε、BDNF、GAPDH和抗小鼠IgG二抗(美国Santa Cruz公司，货号: sc-1681、sc-65514、sc-365062、sc-3697)。NanoDrop 2000分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司); iMark680多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司); ABI Prism® 7300型荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司); BX61电动显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及SCIRI模型的制备: 采用随机数字表法将实验动物分为假手术(sham)组、I/R组、RIPC组、RIPC+miR-NC组、RIPC+miR-31-5p mimic组，每组12只。各组动物经耳缘静脉注入3%戊巴比妥钠1.0 mL/kg麻醉，间断静脉注射3%戊巴比妥钠(0.5 mL/kg)和维库溴铵(0.5 mg/kg)维持麻醉。肝素化(3 mg/kg肝素)后经左侧颈动脉、右侧股动脉分别插管接生理仪连续监测动脉压和心电图，保持血流动力学稳定。并用加热毯保持直肠温度为38 ℃。除sham组外，其余各组动物构建SCIRI模型[8]: 沿左竖脊肌旁纵行切开皮肤，分离裸露腹主动脉; 在左肾动脉下0.5 cm处用无损伤动脉夹阻断腹主动脉血流30 min, 阻断时以股动脉压力波形消失，远端平均动脉压0 mmHg为准，之后开放腹主动脉，逐层缝合皮肤; 阻断腹主动脉血流前5 min, 经耳缘静脉注入肝素150 U/kg预防血栓形成。所有动物术毕肌内注射青霉素40万U, 预防切口感染。sham组不阻断血流30 min, 其余操作同上。

RIPC干预方式: 在SCIRI模型建立前1 h, 暴露分离右侧股动脉, RIPC组、RIPC+miR-NC组、RIPC+miR-31-5p mimic组动物于右侧股动脉近心端皮肤处，用动脉压迫止血器逐步加压，阻断股动脉血流至远心端平均动脉压为0 mmHg, 动脉搏动消失(股动脉波形成一直线)，停止加压持续5 min; 然后松开股动脉压迫，恢复股动脉血流，正常波形呈现，持续5 min。重复以上操作(缺血5 min, 再灌注5 min)4次，累计40 min。RIPC+miR-NC组和RIPC+miR-31-5p mimic组动物在SCIRI前3 d, 每24 h分别经鞘内注射miR-NC、miR-31-5p mimic。

1.3.2 后肢运动功能评分: 再灌注48 h后，根据Tarlov标准[9]对动物后肢运动功能进行评分。评分标准: 0分，无下肢运动，瘫痪; 1分，下肢运动较弱，但不能抵抗重力; 2分，活动良好但不能站立; 3分，能站立和行走但不能正常跳跃; 4分，下肢运动功能正常。实验室人员以不知情的方式给出行为评分，然后比较结果。

1.3.3 血-脊髓屏障(BSCB)通透性检测: 通过定量和定位分析脊髓组织中EB外渗量，可评价BSCB破坏程度和部位。再灌注48 h后，每组取6只兔子，将EB(2%, 10 mL/kg)经兔耳缘静脉缓慢匀速注入, 1 h后再次麻醉，经升主动脉灌注生理盐水(500 mL/kg), 取出脊髓(L4～6节段)，分为2部分。一部分，称重后浸泡于4 mL甲酰胺溶液中, 60 ℃避光水浴24 h, 离心取上清液，用酶标仪在632 nm波长处检测OD值，并采用梯度EB和甲酰胺混合溶液的OD值绘制标准曲线，计算出每克脊髓组织中EB含量(μg/g)。另一部分置于4%多聚甲醛中固定, 1周内沉糖，于-20 ℃连续切片(10 μm), 在荧光显微镜下观察切片。

1.3.4 脊髓组织形态学观察: 再灌注48 h后，每组剩余6只兔子麻醉后，进行心内灌注。灌注后立即取出脊髓(L4～6节段)，将部分脊髓组织浸入10%甲醛中, 4 ℃保存48 h。梯度乙醇中脱水后，包埋在石蜡中。冠状切片切成5 μm厚度并用HE染色以评估结构变化。损伤的神经元通过强烈的嗜酸性细胞质、Nissl颗粒的丢失和核固缩来鉴定。每只动物缺血腹侧脊髓中剩余的正常神经元，根据其形态学外观判断，计数各组中每个切片的正常神经元数量，每个切片随机选择3个切面计数，然后取平均值。

1.3.5 TUNEL检测脊髓组织神经元凋亡情况: 取HE染色制备的切片，经脱蜡和水化后，用蛋白酶K室温下处理15 min, 在3% H2O2中封闭10 min, 并用TUNEL反应混合物处理，在光学显微镜下观察，计算凋亡率。每个切片中随机选择3个神经元丰富的切面，由同一位观察者计数。凋亡率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.3.6 逆转录-实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测脊髓组织miR-31-5p、PKCε和BDNF mRNA表达: 取部分脊髓组织，使用TRIzol试剂分离总RNA, NanoDrop分光光度计测量RNA的浓度和纯度。将RNA反转录为cDNA, 以cDNA为模板在荧光定量PCR仪上进行扩增。循环条件: 95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性15 s, 60 ℃退火20 s, 72 ℃延伸20 s, 总共40个循环。以U6或GAPDH为内参，采用2-△△Ct方法对结果进行分析。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.7 Western Blot检测脊髓组织PKCε、BDNF蛋白表达: 取部分脊髓组织，加入RIPA裂解液，匀浆，然后使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测量蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜在室温下于5%脱脂牛奶中封闭1 h, 然后与一抗(PKCε、BDNF, 1∶1 000; GAPDH, 1∶2 000)在4 ℃下孵育过夜。第2天，蛋白质条带在室温下用HRP偶联的二抗(1∶5 000)孵育1 h, 然后ECL显色，以GAPDH为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 各组后肢运动功能评分

sham组动物的后肢运动功能均正常，评分为4分; 与sham组相比, I/R组动物的后肢运动功能出现严重损伤，评分降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与I/R组相比, RIPC组后肢运动功能评分增加，差异有统计学意义(P<0.05); 与RIPC组和RIPC+miR-NC组相比, RIPC+miR-31-5p mimic组后肢运动功能评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组动物后肢运动功能评分 只

2.2 各组BSCB通透性

sham组脊髓组织内几乎未见红色荧光，与sham组相比, I/R组脊髓组织中可见大量红色荧光，且EB含量增加，差异有统计学意义(P<0.05); 与I/R组相比, RIPC组脊髓组织中红色荧光减弱, EB含量减少，差异有统计学意义(P<0.05); 与RIPC组和RIPC+miR-NC组相比, RIPC+miR-31-5p mimic组脊髓组织中红色荧光增强, EB含量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表3。

A: sham组; B: I/R组; C: RIPC组; D: RIPC+miR-NC组; E: RIPC+miR-31-5p mimic组。图1 各组脊髓组织中EB外渗的荧光图像

表3 各组脊髓组织中EB含量 μg/g

2.3 各组脊髓组织病理学变化

sham组没有明显的组织病理学异常迹象，脊髓神经元结构清晰完整，核仁大而明显，胞浆中存在较多Nissl颗粒; 相比之下, I/R组脊髓神经元数量减少，表现出坏死性改变，空泡化明显，细胞质嗜酸性强烈, Nissl颗粒丢失，胞核固缩。RIPC组和RIPC+miR-NC组脊髓神经元表现出轻度破坏，正常神经元明显增多，少数细胞空泡变性，核仁明显。与RIPC组和RIPC+miR-NC组相比, RIPC+miR-31-5p mimic组脊髓神经元破坏加重，正常神经元数量减少，细胞空泡变性增多，部分胞核固缩。见图2。

2.4 各组脊髓组织神经元凋亡率

在sham组脊髓组织中可见少量TUNEL染色阳性细胞; 与sham组相比, I/R组脊髓中TUNEL染色呈强阳性的细胞数量众多，神经元凋亡率增加，差异有统计学意义(P<0.05); 与I/R组相比, RIPC组脊髓中部分细胞TUNEL染色呈阳性，神经元凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与RIPC组和RIPC+miR-NC组相比, RIPC+miR-31-5p mimic组脊髓中TUNEL染色阳性细胞数增多，神经元凋亡率增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表4。

A: sham组; B: I/R组; C: RIPC组; D: RIPC+miR-NC组; E: RIPC+miR-31-5p mimic组。图2 各组脊髓组织病理学变化(HE染色,放大200倍)

A: sham组; B: I/R组; C: RIPC组; D: RIPC+miR-NC组; E: RIPC+miR-31-5p mimic组。图3 各组脊髓组织神经元凋亡情况(TUNEL, 放大200倍)

表4 各组脊髓组织中神经元凋亡率 %

2.5 各组脊髓组织miR-31-5p、PKCε和BDNF的mRNA表达

与sham组相比, I/R组脊髓组织中miR-31-5p的表达降低,PKCε和BDNF的mRNA表达有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05); 与I/R组相比, RIPC组脊髓组织中miR-31-5p的表达降低,PKCε和BDNF的mRNA表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05); 与RIPC组和RIPC+miR-NC组相比, RIPC+miR-31-5p mimic组脊髓组织中miR-31-5p的表达升高,PKCε和BDNF的mRNA表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

2.6 各组脊髓组织PKCε和BDNF的蛋白表达

与sham组相比, I/R组脊髓组织PKCε和BDNF的蛋白表达有轻微升高，但差异无统计学意义(P>0.05); 与I/R组相比, RIPC组脊髓组织中PKCε和BDNF的蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05); 与RIPC组和RIPC+miR-NC组相比, RIPC+miR-31-5p mimic组脊髓组织中PKCε和BDNF的蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、表6。

3 讨 论

胸腹主动脉和脊柱手术可能导致SCIRI, 进而截瘫。虽然随着新技术的应用，术后截瘫的风险降低，但预防脊髓缺血性损伤仍然是胸主动脉手术中的重点。在RIPC中，组织或器官的短时间非致死性I/R可保护远程组织或器官免受更严重的I/R损伤。研究证据[8, 10]表明, RIPC可诱导脊髓缺血耐受，但其确切机制尚不清楚。BSCB在维持脊髓的稳态方面起着至关重要的作用[11]。在I/R损伤的情况下, BSCB的功能和结构都被破坏，进一步导致神经功能缺损[12-13]。相关报道[14]称, RIPC可在SCIRI后保持BSCB的完整性，并上调脊髓组织中BDNF表达，加强对神经的修复能力。本研究结果与之前的研究一致, RIPC减弱了兔SCIRI后BSCB的破坏，减少了正常运动神经元损伤，并显著上调了BDNF的表达，改善了SCIRI后的肢体运动功能，说明RIPC对兔SCIRI具有显著的防治作用。

表5 各组脊髓组织中miR-31-5p、PKCε和BDNF的mRNA表达

A: sham组; B: I/R组; C: RIPC组; D: RIPC+miR-NC组; E: RIPC+miR-31-5p mimic组。图4 各组脊髓组织中PKCε和BDNF的蛋白表达

表6 各组脊髓组织中PKCε和BDNF的蛋白表达

BDNF是一种促生存信号分子，具有抗炎、抗凋亡和促进神经元再生的神经保护作用，在脊髓损伤的病理生理过程和治疗中起关键作用，与SCIRI后神经功能改善和神经元活力增加有关[15]。已有报道[16]显示，促进BDNF的合成和释放可减轻SCIRI。PKCε属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，是诱导缺血预处理神经保护的关键参与者[17-18], 已被证明在心血管疾病的I/R损伤过程中发挥重要作用，其激活与BDNF的上调有关[19]。研究[20]显示，四肢RIPC可增加PKCε蛋白表达，保护大鼠心脏免受I/R损伤; 且RIPC可增加I/R后脊髓组织中PKCε表达水平，表明RIPC很可能通过激活PKCε蛋白，上调脊髓组织中BDNF的表达。本研究结果显示, I/R后，兔脊髓组织中PKCε和BDNF的表达有轻微上调，这与以往的研究结果一致，推测其原因可能是机体在应激条件下的一种代偿性的保护机制，但是这种上调并不会持续，随着BSCB的破坏，一些分泌BDNF的细胞(如星形胶质细胞、内皮细胞、神经元)的损伤加重，会影响BDNF的表达。而RIPC可通过增加PKCε表达水平和减轻BSCB损伤，上调BDNF的表达水平。

miR-31-5p是众所周知的肿瘤相关miRNA, 参与多种肿瘤的进展[21-22]。研究[22]表明, miR-31-5p在维持非癌组织的病理生理稳态方面起着不可或缺的作用。如miR-31-5p是哮喘和慢性阻塞性肺疾病慢性黏液分泌过多的共同调节剂[23]; 在心肌细胞肥大中, miR-31-5p可以特异性结合PKCε并以剂量依赖性方式抑制PKCε表达; miR-31-5p的抑制或PKCε的过表达可显著逆转心肌细胞肥大，并可能为心肌细胞肥大提供潜在的治疗方法。本研究发现, I/R后，兔脊髓组织中PKCε的增加伴随着miR-31-5p表达水平的降低，而RIPC可显著降低脊髓组织中miR-31-5p的表达，并上调PKCε的表达。分析原因为RIPC可能通过下调miR-31-5p的表达，上调PKCε, 进而增加BDNF表达。为了验证此猜想，本研究在RIPC的基础上，使用miR-31-5p mimic进行干预以上调miR-31-5p, 结果显示, PKCε和BDNF的表达较RIPC组显著降低, RIPC对兔SCIRI的保护作用被显著减弱，这证实了本研究的猜想。

综上所述，在RIPC后, miR-31-5p的表达降低，可激活PKCε蛋白，上调脊髓组织中BDNF的表达，减轻SCIRI。本研究仅初步探究了miR-31-5p在RIPC保护SCIRI中的作用，其是否能调控其他基因或通路参与RIPC，还需进一步研究。