低温等离子体调控细胞增殖和凋亡的研究进展及其在畜牧业的应用

李雅琦，王鲜忠，张姣姣

(西南大学动物医学院，重庆 400715)

等离子体是继固态、液态、气态以外的第四种物质形态，由大量电离的活性粒子如带电离子、自由电子、激发态的原子和分子、自由基以及未电离的中性粒子等组成。根据等离子体产生的温度，可分为高温等离子体和低温等离子体(non-thermal plasma, NTP)。NTP的离子和中性粒子温度远低于电子温度使得整个体系呈现低温(<40 ℃)状态[1]。随着等离子体技术不断深入的研究，NTP已广泛用于口腔治疗[2]、组织再生[3]、皮肤伤口愈合[4-5]和癌症治疗[6-8]等生物医学领域。当组织受损后，局部免疫细胞和成纤维细胞会分泌成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和其它许多生长因子来促进角质形成细胞和内皮细胞的增殖进而促进组织再生[9]。除生长因子外，活性氧(reactive oxygen species, ROS)也是影响细胞增殖的重要因素。研究表明,低水平ROS通过影响细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)促进细胞增殖，而过量的ROS会使DNA和线粒体功能受损，导致细胞周期停止和细胞凋亡[10]。电离辐射和脉冲电磁场等外界因素往往可以通过影响生长因子的释放和细胞内ROS的水平来调控细胞的增殖。NTP对细胞增殖的影响存在强度和时间依赖性[11]，适宜强度和时间的NTP产生的ROS诱导了 FGF-2 的释放，进而促进内皮细胞增殖；但是在高强度和长时间的条件下，NTP产生大量的ROS则会抑制内皮细胞[11]、角质形成细胞[12]和成纤维细胞的增殖[13]；此外，相同条件下，低强度和短时间的NTP处理对正常细胞的活性没有显著影响，但会诱发癌细胞出现生长停止和凋亡现象[7]。因此，不同条件的NTP介导细胞增殖和凋亡与其产生的ROS水平的高低有关。

NTP除了在组织再生、伤口愈合和癌症治疗等生物医学领域的应用以外，目前还主要应用于杀菌消毒[14]、生物净化[15]、疫苗生产[16]和食品加工[17]等方面。本实验室前期研究表明，适宜条件的NTP处理可以促进鸡胚的发育[18]、提高鸡的生长速度和公鸡的繁殖性能[19-22]，并影响仔鸡睾丸支持细胞的增殖能力[23]。NTP的这些作用可能与其辐射类型(包括电场和紫外线辐射)和产生的成分(ROS、活性氮(reactive nitrogen species, RNS)、生物活性物质(NO和H2O2)等)有关[24]，但其具体的作用机制及其在畜牧业的潜在应用目前还不清楚。因此，本文综述了NTP对内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、干细胞和恶性肿瘤细胞的影响及可能机制，为NTP应用于人和动物的伤口愈合和癌症治疗提供理论依据。此外，本文还介绍了NTP在畜禽动物的饲养环境与健康、生长与繁殖性能以及动物食品加工与保存方面的潜在应用，有利于促进我国畜牧业的生产和保障动物食品的安全。

1 NTP在生物医学中的应用

NTP主要有介质阻挡放电(dielectric barrier discharge, DBD)和低温等离子体射流(non-thermal plasma jet, NTPJ)两种类型[25]。CINOGY GmbH PlasmaDerm DBD、AdtecSteriPlas®DBD[26]和MED NTPJ[25]是目前已获得德国CE认证的IIa级医疗设备。NTP技术已广泛用于杀菌消毒[14, 27]、血液凝固[28]、灭活疫苗制备[16]和口腔治疗[2]，此外，由于低强度和短时间的NTP处理具有促进细胞增殖的作用，在临床上有望应用于促进血管生成与组织血管化、伤口愈合与皮肤修复以及组织再生；高强度和长时间的NTP处理具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用，对于癌症治疗和减少疤痕形成具有积极作用(表1)。由此可见，NTP对细胞增殖和凋亡的影响在生物医学领域中展现出了巨大的应用前景。

2 NTP对皮肤相关细胞增殖和凋亡的影响

皮肤是机体抵抗外部病原体入侵的第一道屏障，皮肤严重损伤时常伴有伤口感染，导致伤口愈合的速度缓慢。目前全世界有超过3 800万慢性伤口患者[31]，如何促进皮肤伤口愈合仍然是当前皮肤医学研究的重要难题。大量研究表明，NTP可以有效促进皮肤修复与伤口愈合[4-5]。伤口愈合是一个精准且复杂的过程，包括止血/炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段，其中增殖阶段中内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的大量增殖所形成的新肉芽组织和血管是伤口愈合的关键[32]，因此调控增殖阶段的细胞增殖至关重要。近年来有大量研究报道NTP可以通过影响内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的增殖来促进伤口愈合[11, 33-35]。

表1 NTP在细胞增殖中的应用

2.1 NTP对内皮细胞增殖和凋亡的影响

新生血管的形成对于伤口愈合至关重要。内皮细胞是血管内壁的主要细胞，多种生长因子包括FGF、血管生成素(angiopoietin, Ang)、血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)及转化生长因子(transforming growth factor, TGF)对其具有直接或间接调控作用，可以通过激活并促进内皮细胞有丝分裂来诱导其增殖[36]。其中FGF-2可以通过大鼠肉瘤(rat sarcoma, RAS)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径与细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)结合，从而调节内皮细胞的增殖[37]；当VEGF与血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)结合后，其下游信号分子RAS、MAPK、细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)等发生磷酸化，促进了血管生成[38]。Kalghatgi等[11]发现，低强度和短时间的NTP处理可以通过ROS介导FGF-2释放从而促进内皮细胞增殖，但是长时间的处理则造成了内皮细胞死亡(图1)。Arjunan等[35]也发现，NTP处理以强度依赖的方式使内皮细胞产生ROS，然后通过诱导FGF-2的释放促进内皮细胞的增殖、迁移和血管形成。此外，NTP还可以诱导内皮细胞生长因子FGF-2、Ang-2和VEGF的分泌以及促进生长因子受体FGFR和VEGFR的表达，进而诱导伤口愈合过程中血管的生成[26](图2)。

2.2 NTP对角质形成细胞增殖和凋亡的影响

角质形成细胞是表皮的主要构成细胞，其增殖是影响组织修复和再生的主要因素[39]。Wende等[12]发现，NTP处理时间少于10 s对角质形成细胞的活性无明显影响，但是当处理时间超过30 s后，细胞的数量及活性会随着处理时间的增加而降低(图1)，其主要原因是NTP产生的过量ROS不仅使角质形成细胞的增殖停止在G2/M期，并且使DNA发生氧化损伤从而引起细胞凋亡。H2O2可以通过激活MAPK/ERK通路，诱导人支气管上皮细胞中白介素-8 (interleukin-8, IL-8)的合成，进而影响细胞活性[40]。MAPK/ERK信号通路可以通过影响G1/S期Cyclin D1、凋亡相关蛋白和其他效应分子的表达来促进细胞增殖和抑制细胞凋亡[41]。研究表明，NTP可以通过产生的ROS与RNS触发 ERK磷酸化，从而激活Cyclin D1和周期蛋白依赖性激酶，显著促进了角质形成细胞的增殖，进而加速了皮肤伤口的愈合[42](图2)。此外，细胞内K+渗漏也会激活 ERK[43]，Hotta等[44]发现，NTP可以通过刺激细胞内K+渗漏使ERK激活，从而诱导细胞中IL-8 mRNA的表达，进而促进了人角质形成细胞的增殖。

图1 NTP对细胞活性的影响Fig.1 Effects of NTP on the cell activity

图2 NTP调控细胞增殖和凋亡的可能机制Fig.2 Possible mechanisms of NTP regulating cell proliferation and apoptosis

2.3 NTP对成纤维细胞增殖和凋亡的影响

在伤口愈合的过程中，增殖的成纤维细胞通过产生和沉积胶原蛋白和纤连蛋白，形成临时的细胞外基质，为伤口愈合过程中组织的增生提供支持和营养，然而成纤维细胞的持续增殖和细胞外基质的过度沉积均会导致肥厚性瘢痕。利用NTP处理人包皮成纤维细胞，发现H2O2导致PBS缓冲液酸化，从而抑制了成纤维细胞的增殖，这表明NTP可能对过度增生性皮肤疾病具有较好的治疗作用[13]。成纤维细胞可以合成和分泌EGF、TGF和FGF等生长因子，这些生长因子可以直接刺激成纤维细胞的增殖[45]。当细胞受到生长因子的作用时，p50/p65/IκBα三聚体上IκBα亚基的残基发生磷酸化，已磷酸化的IκBα被泛素化和蛋白酶体降解，使p65发生磷酸化，进而诱导NF-κB的活化[46]。作为一种DNA 结合蛋白，NF-κB可以通过增强Cyclin D1的表达来促进细胞从G1期进入S期，研究表明利用NTP处理小鼠成纤维细胞可以诱导ROS的产生，抑制IκB的表达使p65发生磷酸化，进而激活NF-κB信号通路，增加S期DNA的合成，从而促进成纤维细胞的增殖[29](图2)。NTP对成纤维细胞的增殖调控具有时间依赖性，当NTP处理小鼠伤口的时间在10～40 s时，伤口愈合的时间与对照组相比显著缩短，但处理时间超过50 s时，伤口愈合的效果没有明显改善，这可能与NTP产生的ROS和RNS水平有关[47]。此外，适宜时间的NTP处理还可以通过灭活伤口周围的细菌来激活伤口组织中的成纤维细胞增殖，最终促进伤口的愈合，但长时间的处理则会导致细胞凋亡或坏死，进而抑制伤口愈合[47]。

总之，较低强度和较短时间的NTP处理有利于皮肤相关细胞的存活及增殖，但是较高强度和较长时间的NTP处理则会引起细胞停止增殖或细胞凋亡(图1)。因此，优化NTP处理条件有望应用于促进皮肤伤口的愈合和抑制皮肤疤痕组织的过度增生。

3 NTP对干细胞增殖的影响

干细胞具有促进受损组织修复和再生的潜力，精准地调控干细胞的增殖、分化和凋亡环节对于再生医学和组织工程都至关重要。干细胞所具有的参与免疫调节与细胞因子和生长因子分泌的能力，使其成为治疗慢性伤口愈合的潜在工具[48]。已有研究表明，NTP可以通过改变干细胞生态位界面和直接刺激干细胞两种方式来促进干细胞的增殖并保持其干性[30]。

3.1 NTP通过改变生态位界面促进干细胞增殖

生物材料的表面性能对于细胞的附着和增殖十分重要[49]。多能干细胞在疏水性培养皿中的黏附性差，聚苯乙烯作为一种疏水性材料，不能为干细胞提供有利的生长环境，然而利用NTP处理聚苯乙烯材料后，其表面变为亲水性，可以更好地为干细胞提供黏附生长及增殖的条件[50]。Prasertsung等[51]利用NTP处理明胶膜，使其亲水性和表面能均提高，更有利于骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSTs)的附着，进而诱导其增殖。Cámara-Torres等[3]通过NTP处理3D 聚合物熔体增材制造的支架后增加了支架表面的亲水性和蛋白质吸附力，进而改善了MSTs的分布和增殖。因此，NTP可以改变涂层材料的生物学功能，增强干细胞在培养皿的黏附进而间接促进干细胞增殖。

3.2 NTP通过直接刺激促进干细胞增殖

MSTs具有分化为多种细胞类型(如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和神经元)的潜力，但是很难在体外培养中保持其干性。NO作为细胞内第二信使，可以通过 PI3K-AKT信号通路激活一氧化氮合酶，进而激活ERK通路，促进干细胞的增殖[52]。Park等[53]发现，在不影响MSTs干性的情况下，利用NTP直接处理MSTs后，产生的NO能够激活AKT/ERK通路以及磷酸化NF-κB，进而促进了MSTs的增殖(图2)。此外，NTP处理还使细胞周期从G1期加速进入到S期，从而显著提高了MSTs和造血干细胞的增殖[48](图2)。为了进一步探索NTP促进干细胞增殖的机制，Park等[54]通过全基因组RNA测序发现，NTP处理产生的NO通过表观遗传的方式使细胞因子和生长因子的mRNA和蛋白水平表达上调，但是凋亡途径相关基因的mRNA 和蛋白水平的表达下调。因此，NTP可以通过直接和间接两种方式促进干细胞的增殖并保留其干性，这将有利于解决干细胞在再生医学和细胞移植等领域的应用难题。

4 NTP对肿瘤细胞凋亡的影响

癌症是全球范围内最主要的死亡原因之一，2020年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的数据显示，中国大约有450万新癌症病例发生，其中死亡率占65.73%[55]。目前治疗癌症主要通过手术、化学疗法和放射疗法3种方式，但是这3种方法都存在一定的局限性。最近已有研究表明NTP有望应用于癌症治疗，其原因是NTP可以抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖和诱导恶性肿瘤细胞发生凋亡，并且对正常细胞没有损伤[56]。

利用相同条件的NTP处理正常的人支气管上皮细胞和肺癌细胞两种细胞系，发现NTP使肺癌细胞的数量显著降低，但对正常的支气管上皮细胞的数量几乎没有影响[56]。对人非小细胞肺癌细胞、人宫颈癌细胞、人肝成纤维细胞瘤细胞和正常的人皮肤成纤维细胞进行NTP处理，发现NTP对肿瘤细胞的抑制作用比对正常细胞的抑制作用更为显著[6]。也有研究表明，利用NTP处理培养基后进行癌细胞的培养，其效果与NTP直接处理癌细胞的效果一致。通过NTP处理培养基后进行皮肤鳞状细胞癌细胞、人乳腺癌细胞系、肺癌细胞系、结肠癌细胞系和胰腺癌细胞系的培养，发现NTP以强度和时间依赖性的方式抑制了恶性肿瘤细胞的增殖[57]。无论是直接处理癌细胞还是间接处理培养基后再培养癌细胞，NTP抑制肿瘤细胞增殖的机制与NTP产生的ROS诱导了肿瘤细胞增殖相关基因的表达失衡有关[6, 56-57]。

癌细胞中的ROS水平比正常细胞高，与正常细胞相比癌细胞对氧化应激更敏感[58]。过量的ROS可以通过诱导DNA损伤与激活肿瘤抑制因子p53引起癌细胞的凋亡[58]。Chang等[59]发现，利用NTP诱导的口腔鳞状细胞癌细胞凋亡与DNA损伤和共济失调毛细血管扩张突变(ataxia telangiectasia mutated, ATM)/p53信号通路表达的增强使G1期停滞有关(图2)。NTP与放疗对癌细胞具有协同抑制作用，其原因是NTP产生的ROS诱导了DNA损伤以及G2/M期停滞，进而使癌细胞发生凋亡[6]。此外，癌细胞凋亡还可以通过外在的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)受体家族途径或内在的线粒体途径，导致含半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)级联激活，进而引起了细胞凋亡。研究表明NTP所产生的ROS通过激活TNF通路诱导了凋亡信号调节激酶1 (apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)及其下游 p38 MAPK 或Jun细胞核激酶(Jun nuclear kinase, JNK)的表达，进而启动caspase-3/7反应使黑色素瘤细胞发生凋亡[60](图2)。因此，NTP产生的外源性ROS可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，而细胞内ROS的水平也是影响细胞信号传导、细胞增殖和细胞死亡的重要因素。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2, NOX2)可以通过NADPH依赖的单电子还原将细胞内氧分子还原成超氧负离子，NOX2是细胞内ROS的主要来源和细胞内直接产生ROS的酶[61]。NOX2产生的细胞内ROS可以通过激活ASK诱导p38 MAPK的表达[60]。Ishaq等[62]发现，NTP处理能够通过NOX2-ASK1途径诱导结直肠癌细胞发生凋亡(图2)。

NTP产生的ROS可以直接转运进入癌细胞，当处理时间和强度超过特定阈值时会引起细胞氧化应激，使DNA发生氧化损伤，并诱导细胞凋亡相关信号通路，导致癌细胞增殖停止和癌细胞凋亡，但对正常细胞的毒性较小甚至没有毒性。因此，在正常细胞与恶性肿瘤细胞之间存在NTP的最佳处理剂量，使其有望应用于癌症的临床治疗(图1)。

5 NTP在畜牧业的潜在应用

畜牧业是现代农业的重要组成部分，环境污染、抗生素滥用等诸多因素严重影响了我国畜牧业的经济发展以及动物和人类的健康安全，寻找提高畜牧业生产和确保动物源性食品安全的新技术和新方法，是当前我国畜牧业健康发展的迫切需求。NTP作为一种安全环保且无毒的技术，在畜牧业领域具有潜在的应用价值[15]。本文主要关注了其在畜禽动物的饲养环境与健康、动物生长与繁殖性能、动物食品加工与保存等方面的应用。

5.1 NTP改善畜禽饲养环境与健康

饲养环境中存在的各种微生物及动物排泄物会增加动物的患病机率，对畜禽饲养环境进行净化不仅能够为动物提供健康舒适的生长环境，而且有利于减少生物污染。研究表明NTP不仅能够有效灭活环境中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、痤疮皮肤杆菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌[14, 27]，还可以降解空气中的有害挥发性有机化合物和气味[15]。由此可见，NTP具备净化畜禽饲养环境的潜力。除了通过改善饲养环境间接保障畜禽健康以外，还可以通过直接给畜禽注射疫苗来提高其抗病能力，其中灭活疫苗对我国畜牧业的健康发展发挥着越来越大的作用。目前NTP已用于新城疫病毒和H9N2流感病毒灭活疫苗的制备，利用适当时间的NTP处理来灭活病毒，不会破坏其抗原决定簇，并且与传统的利用剧毒试剂甲醛灭活疫苗相比，NTP可以诱导更高的特异性抗体滴度[16]。因此，NTP有望用于改善畜禽的饲养环境和保障动物的生命健康。

5.2 NTP提高畜禽生长与繁殖能力

畜禽动物的生长与繁殖性能直接关系到我国畜牧业的生产水平和经济发展。近年来本实验室利用NTP在家禽的生长与繁殖性能调控方面做了一系列研究工作[18-23]。利用NTP处理不同胚龄的鸡胚，发现适宜放电电压和时间的NTP处理HH20期胚胎可以促进鸡胚的发育，但是高剂量的NTP则以剂量依赖的方式破坏了抗氧化信号通路，引起ROS过度积累，降低了胚胎发育相关基因和蛋白的水平以及骨骼肌中ATP的浓度，从而导致了鸡胚死亡[18]。适宜条件NTP处理的鸡胚在孵化后，其日均增重和胫骨长度均显著提高，研究发现NTP通过控制线粒体呼吸代谢和抗氧化防御系统来调节ATP水平和ROS稳态，并通过调节骨骼肌和甲状腺中生长相关激素生物合成基因及能量代谢相关基因的去甲基化水平，提高了甲状腺激素、生长激素、胰岛素样生长因子等的表达，进而提高了鸡的生长速度[19, 22]。

精液品质是动物繁殖性能的重要指标，与受胎率、产仔数量以及后代的成活率等密切相关[63]。精子DNA低甲基化水平可以促进胚胎的发育和分化，而高甲基化则会导致精子发生障碍和精子质量缺陷[64]。体内外试验表明，适宜条件的NTP可以通过DNA去甲基化和miRNAs差异表达增加血清睾酮和精子ATP水平，并通过调控精液ROS稳态和精子线粒体代谢提高了公鸡的精液质量和繁殖率[20-22]。此外，NTP以剂量依赖的方式通过miR-7450和miR-100靶向调节一磷酸腺苷活化蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白信号通路，进而影响了仔鸡睾丸支持细胞的增殖，有利于为精子生成提供营养和结构支持[23]。因此，NTP可以应用于提高家禽的生长与繁殖性能，但NTP是否能够促进家畜的生长和繁殖能力目前尚不清楚，处理条件的优化及其作用机制还有待更多的研究。

5.3 NTP有利于动物食品加工与保存

新鲜动物食品在储存期间由于微生物污染容易变质甚至腐烂，因此对新鲜的动物食品进行加工可以延长其保质期[65]。NTP产生的ROS、RNS和NO在肉制品微生物的灭活和亚硝酸盐的生成过程中起着关键作用[17]。亚硝酸盐作为一种食品添加剂，用于腌制肉制品和防止肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌等病原微生物的污染[66]。利用NTP处理来腌制猪肉火腿和香肠，一方面NTP产生的活性物质可能直接通过破坏微生物DNA引起微生物的死亡，另一方面NTP处理形成的亚硝酸盐可以更好地保持猪肉的色泽、风味以及脂质氧化特性[17]。同时NTP作为一种安全有效的技术已应用于延长动物食品的保质期[67]，利用NTP可以有效灭活新鲜鸡肉、猪肉和牛肉上的李斯特菌、大肠杆菌和沙门菌[68-70]，减少牛奶中的大肠杆菌[71]以及鸡蛋表面的沙门菌[72]，并且对肉质、奶质和鸡蛋品质没有任何负面影响[70-71]。此外，NTP杀菌消毒的优势在动物食品的密封包装中也得以应用，研究表明利用NTP 可以灭活密封袋中的大肠杆菌[73]，有效延长包装袋中鸡胸肉的保质期[67]。因此，NTP能够在动物食品的加工过程中发挥重要作用，有利于延长动物食品的保存期限。

6 展 望

随着NTP技术的不断发展，NTP被越来越多地应用于生物医学领域，并且在畜牧业领域也表现出了巨大的应用潜力。一方面，NTP可以在一定程度上促进皮肤相关细胞和干细胞的增殖，有利于伤口愈合和组织再生；另一方面，NTP能够引起恶性肿瘤细胞死亡，有利于癌症治疗。NTP对细胞增殖和凋亡的影响主要是以强度和时间依赖的方式产生ROS、RNS和NO等生物活性物质，使细胞内的氧化还原平衡发生了改变，进而通过调控细胞增殖和凋亡相关信号通路来发挥作用。因此，控制NTP处理的强度和时间显得尤为重要，研究NTP诱导细胞功能变化的分子机制，能够为NTP应用于临床治疗提供依据。此外，NTP在杀菌消毒、疫苗制备以及改善家禽生长与繁殖能力等方面的作用有望使其应用于畜牧业，但是其处理条件需要进行优化，并且其作用机制还有待深入研究，尤其是利用NTP安全精准地调控畜禽的生长发育与繁殖性能，将有利于促进我国畜牧业的健康发展。