霉变三七粉中病原菌的分离鉴定

和玉凤，张关能**，刘恩芬，付玲凡，和春龙

(1.云南联大科技产业有限责任公司，云南 昆明 650500；2.云南中烟再造烟叶有限责任公司，云南 昆明 650106)

三七(Panaxnotoginseng)，又名人参三七、田七、文州三七、参三七，味甘，微苦，无毒，是中国享誉海内外的传统名贵中药材，其根和叶都可以做药，具有“散瘀止血、消肿定痛、益气活血”等效果[1]。现代药理药效研究[2-5]发现，三七对心脑血管系统、代谢系统、血液系统、神经系统、免疫系统疾病防治都有显著的疗效，有享“参中之王”“金不换”“南国神草”等美誉。

三七的成分构成十分复杂，其中含有多糖、黄酮、三七皂苷、多种微量元素、多肽类化合物[6]等化学物质，这些成分是三七吸水性较强的主要因素。因此，在三七的生产、加工、包装、运输、存储等过程中，即使已经加强注意，但三七还是容易出现发霉、变质等现象[7]。云南作为三七的主产区，全国95%以上的三七都来自云南。据行业协会统计，云南省在2015年，三七种植面积就达到6.72万hm2(100.8万亩)，三七交易收入高达103亿元人民币，三七的年产量为4.9万吨[8]。随着国家的技术支持，三七种植贮藏规模也越来越大，出现的霉变情况也随着增多，造成的损失也越来越大。宋美芳等[9]从自然储藏后霉变的三七中分离到拟青霉属、青霉素和镰刀菌属真菌，其中淡紫拟青霉和桔青霉为优势菌，同时分离到三七致病菌尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌。王炳艳等[10]采用发霉三七挑选出菌丝进行培养和纯化，分离到了米曲霉舒展变种、塔宾曲霉、日本曲霉原变种、炭黑曲霉、粒落曲霉、寄生曲霉、聚多曲霉、毒曲霉、合阳曲霉、多育曲霉、溜曲霉、两形头曲霉、肇庆曲霉和黄曲霉柱头变种等14种曲霉。

本研究从霉变的三七粉中分离出了赭绿青霉(P.ochrochloron)、橘青霉(P.citrinum)、黄曲霉(A.flavus)、拜赖青霉(Penicilliumbilaiae)、草酸青霉菌(P.oxalicum)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和土曲霉(A.terreus)等7种霉变真菌，并鉴定出了橘青霉和黄曲霉两种，结果表明霉变三七中已经含有霉菌毒素，建议人们不要食用已霉变三七，也为三七存储提供一些参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

三七粉：采购于文山三七国际交易市场。

PDA培养基：用天平称取马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂粉 20 g(液体培养基不加)，自然pH。配制的方法为：将土豆去皮后称重，切成小块或丝状，保持沸腾状态15～20 min，期间不断搅拌，防止锅底的淀粉沉淀煮糊，采用双层纱布进行过滤，然后加入葡萄糖，用水定容至 1 L，进行分装并封口，后于 121 ℃ 高温灭菌锅中灭菌 30 min。

1.2 方法

1.2.1 真菌菌株的分离和纯化

用天平秤取 10 g 三七粉装入 250 mL 锥形瓶，再用量筒量取 100 mL 无菌水加入锥形瓶，此时相当于稀释了10倍，放入 28 ℃、160 r/min 的条件下振荡 30 min，静置 5 min，在超净工作台中取上清液梯度稀释为100倍、 1000倍，分别取各浓度稀释液 0.2 mL，加到直径为 9 cm 的培养皿中，进行涂板。使用已灭菌的固体PDA培养基，加热融化，待冷却至 50 ℃ 左右加入氯霉素(使氯霉素质量浓度为 10 μg/mL)后倒板，放置 30 min 左右冷却凝固后即可以涂板，每个梯度的涂4皿，同时用无菌水涂4个板作为对照，涂板完成后用封口胶封口，置于 28 ℃ 的培养箱中，黑暗培养 4 d。取出培养基，数清菌落数。用接种针挑选出含真菌单菌落的样本，转移到其他新的培养基上，得到单一真菌，如果得到的不是单菌落再重复上一步。

1.2.2 形态学鉴定

用接种针挑取出单一真菌，接种于PDA培养基上，观察菌落形态相同的视为同一菌株，筛选到9个菌株，分别标记为37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6和37-7、37-8和37-9。

根据霉变菌落、分生孢子形态及分生孢子梗的观察结果，参考《常见与常用真菌》[9]《真菌鉴定手册》[10]进行霉变菌的形态鉴定。

1.2.3 真菌的rDNA-ITS分子鉴定

按真菌rDNA-ITS分子鉴定法提取DNA，通过参考曹永军等[11]的步骤进行扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送到昆明擎科生物科技有限公司测序。

1.2.4 生物信息学分析与系统发育树构建

根据测序结果并在NCBI的GenBank数据库中比对找出同源序列，利用分子进化遗传分析软件(MEGA5.1)通过邻接法构建各菌株相关基因标记的系统发育树，综合形态鉴定结果，进一步鉴定个菌株所属的种属分类地位。

2 结果与分析

2.1 菌株分离结果

分离后根据细菌、真菌和放线菌菌落形态的不同进行初步筛选，筛选结果见表1。

表1 初步分离菌落数

从结果看，分离时出现了大量的细菌菌落，经形态观察，大致分为6种，其中5种表面干燥，应该为革兰氏阳性菌；同时有一皿出现5个放线菌菌落，这些菌落在PDA培养基菌落致密，菌落呈放射状，表明干燥，菌落为白色，5个菌落形态大致相同，可能是同一种放线菌。根据霉菌形态大致相同的并为1种，分离到9株真菌。

2.2 真菌形态鉴定

把2.1中分离到的9株真菌，按37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6、37-7、37-8和37-9标识，并观察真菌菌落形态，如图1所示。对曲霉和青霉的分生孢子和菌丝进行观察，如图2所示。

图1 霉菌菌落形态(37-1到37-9)

图2 曲霉和青霉分生孢子和菌丝

结合分子鉴定结果可知，37-1、37-4和37-7都可能是拜赖青霉；同时，通过菌株孢子的观察，37-5、37-6、37-9分生孢子梗末端为具有顶囊，顶囊表面四周或上半部着生一层或两层呈辐射状排列的小梗，应该为曲霉。37-2、37-3和37-8等几个菌株的分生孢子梗顶端多次分枝成扫帚状、分枝顶端着生小梗，符合青霉分生孢子形态[12]。

2.3 真菌分子鉴定

2.3.1 扩增产物rDNA测序条

对扩增产物用测序仪进行分析测定，通过NCBI分子鉴定比对结果：37-1与Penicilliumbilaiaestrain CV1429相似度为100%；37-2与Penicilliumoxalicumisolate HC6相似度为99.83%；37-3与Penicilliumochrochloronisolate 38 相似度为100%；37-4与Penicilliumbilaiaestrain CBS 330.95相似度为100%；37-5与Aspergillusfumigatusstrain ASK16相似度为100%；37-6与Aspergillusterreusisolate OAT相似度为100%；37-7与PenicilliumbilaiaeNRRL 3391 相似度为99.82%；37-8与PenicilliumcitrinumstrainKACC43900 相似度为100%；37-9与Aspergillusflavusstrain CMXY27600相似度为100%。

2.3.2 构建系统发育树

因为菌株较多，本文选取一个青霉(37-1)，一个曲霉(37-5)构建系统发育树。

2.4 结果分析

通过NCBI分子鉴定比对结果，用系统发育树鉴别菌株亲缘关系，再结合形态鉴定可得：37-1与Penicilliumbilaiaestrain CV1429相似度为100%，为拜赖青霉；37-2与Penicilliumoxalicumisolate HC6相似度为99.83%，为草酸青霉菌；37-3与Penicilliumochrochloronisolate 38 相似度为100%，为赭绿青霉；37-4与Penicilliumbilaiaestrain CBS 330.95相似度为100%，为拜赖青霉；37-5与Aspergillusfumigatusstrain ASK16相似度为100%，为烟曲霉；37-6与Aspergillusterreusisolate OAT相似度为100%，为土曲霉；37-7与PenicilliumbilaiaeNRRL 3391 相似度为99.82%，为拜赖青霉；37-8与PenicilliumcitrinumstrainKACC43900 相似度为100%，为橘青霉；37-9与Aspergillusflavusstrain CMXY27600相似度为100%，为黄曲霉。

3 讨论

在实验过程中发现，分离时细菌菌落数远远多于真菌菌落数量，考虑其中一些菌落中，存在一些具有抑制真菌生长的细菌。为了验证这个猜想，又进行了一系列实验。

3.1 拮抗细菌的筛选

初步筛采用菌落对峙试验，用接种针挑取黄曲霉接种于PDA平板中央， 3 cm直径外用接种环接种6个菌株(Z-1到Z-6)菌液，28 ℃ 培养7 d， 观察生长状况及抗菌表型。结果Z-1到Z-4都有抑菌作用，Z-1效果最好，结果见图3。另外，三个较差，所以淘汰掉效果不好和没有效果的菌株，只留下Z-1。

图3 Z-1对黄曲霉的抑制作用

3.2 Z-1的鉴定

因为Z-1效果很好，所以对该菌株进行了生理生化鉴定和分子鉴定。菌株的生理生化特征结果见表2。

表2 菌株Z-1的主要生理生化特征

生理生化鉴定参考，分子鉴定参考。NCBI对比结果显示Z-1与Bacillusvelezensisstrain CD91相似度达到100%，结合生理生化鉴定结果，可以鉴定Z-1为丝状芽孢杆菌(Bacillusvelezensi)。霉菌广泛分布于自然界，不少霉菌都会产生对人畜有害的霉菌毒素。因此霉菌与霉菌毒素对食品的污染越来越受到人们的重视。中药材受到真菌污染的情况很常见，各种药材受到真菌污染程度不同，污染真菌种类也不同。国外，Wongwiwat Tassaneeyakul 检测了泰国28种中药产品，受到黄曲霉毒素污染中药产品有18%[17]。M.Halt对62份药用植物和11份药茶用品进行检测，赭曲霉毒素和黄曲霉毒素为主要污染毒素[18]。国内，陈微对18种中药材表面真菌及真菌毒素污染研究发现12种优势真菌中10种以可以产毒，产生的毒素包括黄曲霉毒素[19]。宋美芳等对云南草果表面真菌进行分离鉴定表明草果污染菌中的优势菌为淡紫拟青霉和黄曲霉[20]。Z-1菌株对黄曲霉抑制效果极为显著，具有极高的生防潜力。

4 结论

实验从霉变三七粉中分离得到9个菌株，其中有3个曲霉和6个青霉，有3个青霉为同一种，即分离得到2属7种霉菌，其中的桔青霉，烟曲霉和黄曲霉都会产生霉菌毒素。表明霉变的三七粉受到霉菌毒素污染的威胁。三七粉的价格相对较高，在日常生活中，往往会由于存贮不当或者存放时间太长等一些情况导致三七粉发生霉变现象，有些肉眼看到的霉变情况不太严重，直接丢弃比较浪费。三七粉具有药用价值，仅考虑可能降低了药效，但是往往忽略了霉变产生的霉菌毒素的摄入可能对身体带来更大的危害，有些毒素含量达到一定的浓度，甚至可能致死。