Hippo 信号通路在大白猪不同直径卵泡中的表达特征研究

周 梅,徐成良,王洁茹,李小金,张 威,储明星,王重龙*

(1 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,猪分子数量遗传学安徽省农业科学院重点实验室,畜禽产品安全工程安徽省重点实验室,合肥 230001；2 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,农业农村部动物遗传育种与繁殖(家禽)重点实验室,北京 100193)

产仔数性状是猪最重要的经济性状之一,与猪场的效益直接相关。然而,涉及产仔数的生理调控机制非常复杂,包括卵泡发育-排卵-分娩等一系列环节[1]。据报道,排卵数对猪的产仔数和产活仔数具有决定性的影响,而哺乳动物原始卵泡的数量在出生后就已确定且不再发生改变,卵泡发育以一批接着一批卵泡波的形式相继生长和退化,只有发育成熟的卵泡才能到达排卵位置[2-3]。早在1990年,李汝敏等[4]对高产的二花脸猪研究发现,正常的等级卵泡在总卵泡中所占的比例与猪的产仔数直接相关,但至今猪卵泡发育的调控机制仍不够明晰,故对其调控通路进行研究对于其机制的阐明至关重要。

近年来有研究显示,Hippo 信号通路可能在哺乳动物卵泡发育中可能发挥潜在调控作用,且该通路在物种间高度保守[5]。Xiang 等[6]研究发现,Hippo 通路的核心组分哺乳动物不育系20 样激酶1(Mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)、大肿瘤抑制激酶2(Large tumor suppressor kinase 1,LATS2)以及YAP的表达随着小鼠的卵泡发育而发生改变,尤其是在原始卵泡激活前后变化显著,且与原始卵泡池的大小具有时空相关性。Sun 等[7]研究发现,小鼠卵母细胞在排卵前通过抑制Hippo 组分的表达来诱导颗粒细胞增殖,在排卵期间又通过及时激活Hippo 信号传导活性促进颗粒细胞分化,说明Hippo 信号通路在小鼠颗粒细胞的增殖和分化中均发挥重要作用。有报道称,Hippo 信号通路成员MST1∕2、LATS1∕2 以及YAP在绵羊睾丸成熟过程中表达量逐渐增加,且在射出的精子中高度表达,表明该通路在雄性哺乳动物青春期发育及精子发生过程中也发挥着重要作用[8]。Hippo 信号通路影响小鼠卵泡发育,但是其确切作用仍然未知,在体外或体内灭活小鼠颗粒细胞中的LATS1∕2 会导致颗粒细胞形态、功能和基因表达的丧失[9]。本试验以大白猪为对象,研究Hippo 信号通路在其不同直径卵泡中的表达特征,以期为阐明猪的卵泡发育调控机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集和处理

从长丰农牧屠宰场现场采集大白猪新鲜卵巢组织,置于4 ℃无菌的PBS 溶液中尽快带回实验室,清洗处理后置于无菌的0.9% NaCl 溶液中。用10 mL 无菌注射器抽取不同直径卵泡液(小卵泡,＜3 mm；中卵泡,3—5 mm；大卵泡,＞5 mm),经400 目(孔径425 μm)筛网过滤后收集细胞混合液,800 r∕min 离心5 min 后取细胞沉淀,用TRizol 和试剂盒法对不同直径卵泡细胞进行总RNA 提取,用Nanodrop 2000 核酸测定仪对各RNA 样品的纯度和浓度进行测定,然后置于-80 ℃冰箱备用。

1.2 引物设计

根据GenBank 提供的猪LATS1、LATS2、MOB1、MST1、MST2、SAV1 以及YAP基因mRNA 序列(登录号依次为XM_005659149.3、XM_021065128.1、NM_001179454.1、XM_003132215.4、NM_001019167.2、XM_001927720.7 和XM_021062706.1)为模板,利用Primer 3 在线软件进行跨外显子引物设计,以β-actin(登录号为NM_001009784)作为内参基因。引物由合肥欣捷智生物技术有限公司合成,具体信息见表1。

1.3 反转录和qPCR 反应

利用TAKARA 反转录试剂盒先去除基因组DNA 后再进行反转录反应,去除基因组DNA 的体系(50 μL)和反应条件为:5 ×gDNA Eraser Buffer 10.0 μL,gDNA Eraser 5.0 μL,Total RNA 2.5 μg,再用RNase Free dH2O 补至总体积50 μL,42 ℃反应2 min；反转录体系(100 μL)和反应条件为去除gDNA 的反应液(50.0 μL),PrimeScript RT Enzyme Mix I 5 μL,RT Primer Mix 5 μL,5 ×PrimeScript Buffer 2 20 μL,RNase Free dH2O 20 μL；37 ℃15 min,85 ℃5 s,4 ℃保存。反转录产物进行5 倍稀释后用于qPCR 反应,反应在Roche Light Cycler®R480 Ⅱ型荧光定量PCR 仪中进行,每个样品重复检测3 次。qPCR 体系(25.0 μL)和反应条件为:SYBR Premix Ex Taq II 12.5 μL,PCR Forward Primer 1.0 μL,PCR Reverse Primer 1.0 μL,cDNA 2.0 μL,dH2O 8.5 μL；95 ℃预变性5 s,95 ℃变性5 s,60 ℃30 s,40 个循环；反应结束后对熔解曲线进行分析。

1.4 数据分析

采用2-ΔΔCt法[10]对qPCR 结果中目的基因的相对表达量进行计算,利用SPSS 20 统计软件按照分析-比较均值-单因素ANOVA 的方法对不同直径卵泡之间各基因的表达量进行差异显著性分析。

2 结果与分析

经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现,提取的不同直径卵泡总RNA 完整性良好,无明显降解,且浓度和纯度均符合要求,可直接进行反转录。反转录成cDNA 后,同时用各基因对应的引物和β-actin引物进行qPCR 扩增,熔解曲线均为单峰,表明引物特异性很好,可用于后续的qPCR 试验。根据qPCR 检测结果对Hippo 信号通路(LATS1∕2、MOB1、MST1∕2、SAV1 和YAP)在不同直径卵泡中的表达进行分析,具体结果见图1。

图1 Hippo 信号通路核心因子在不同直径卵泡中的表达Fig.1 Expression of core factors of Hippo signaling pathway in follicles with different diameters

从图1 可以看出,Hippo 信号通路的7 个核心因子在不同直径猪卵泡中的表达均达到了差异显著水平,其中LATS2 的表达量随着卵泡直径的增大极显著增加(P＜0.01),而MOB1、MST1、MST2 以及YAP的表达量则随着卵泡直径的增大显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)下降。另外,LATS1 和SAV1 都是在中卵泡中表达量最高,显著高于小卵泡和大卵泡(P＜0.05)。

3 讨论与结论

哺乳动物卵泡发育过程受多条信号通路调控,如雌激素受体信号通路[11]、转化生长因子β(Transforming growth factor β,TGFβ) 信 号 通 路[12]、TGFβ∕SMAD 信 号 通 路[13]、骨 形 成 蛋 白(Bone morphogenetic protein,BMP)∕SMAD 信号通路[14]、磷脂酰肌醇3 激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI-3K)∕蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)信号通路[15]以及Wnt 信号通路[16]等。Hippo 信号通路处于一个复杂的调控通路网络之中,与TGFβ、BMP∕SMAD 以及Wnt 信号通路间均存在相互作用,暗示该通路可能在哺乳动物卵泡发育中也发挥着潜在的重要作用。目前,关于Hippo 信号通路在卵泡发育中作用的报道多集中在小鼠上[17],本研究是初次对Hippo 信号通路核心因子在猪卵泡发育过程中的表达特征进行分析,旨在探索影响卵泡发育的因素及可能的作用方式。

qPCR 结果表明,LATS1∕2、MOB1、MST1∕2、SAV1 以及YAP基因在猪不同直径卵泡中的表达均达到了差异显著水平,其中LATS2 基因在大、中、小卵泡之间的表达量差异均达到极显著水平,且表达量随着卵泡直径的增大而增加,表明其可能通过增加自身的表达量来促进卵泡的生长。这与牛小天[18]在鸡上报道的研究结果不太一致,可能是因为哺乳动物与家禽在生理生殖调控中存在较大差异有关。MOB1 基因在不同直径卵泡中几乎不表达,推测其可能在猪卵泡发育中作用不是最关键的。而MST1、MST2 以及YAP基因的表达特征均与LATS2 基因相反,推测它们表达的增加可能会抑制卵泡的生长。通过以上结果,可以推测Hippo 信号通路的LATS2、MOB1、MST1、MST2 以及YAP基因与猪的卵泡发育密切相关,但各核心因子的调控方式与在鸡[18]和小鼠[19]等物种中的调控模式并不完全一致,具体的调控机制还需要进一步的验证。下一步计划将在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中验证各基因敲除或过表达对细胞增殖或凋亡等的影响,以明确其作用的分子机制。

本研究初步得出以下结论:Hippo 信号通路核心因子LATS2 在猪卵泡发育中发挥正调控作用,而MOB1、MST1、MST2 以及YAP则发挥着负调控作用。