湖北地区养殖河蟹(Eriocheir sinensis)组织中微塑料的赋存特征

张洁馨，陆 星，文 华，伍 刚，甘金华，彭 婕，喻亚丽，毛 涛，周剑光，刘 婷，张 浪，何 力①

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所,湖北 武汉 430223;2.武汉大学基础医学院,湖北 武汉 430071)

塑料污染与全球气候变化、海洋酸化、臭氧耗竭等并列成为全球性重大环境问题[1]。根据美国国家海洋和大气管理局(NOAA)的定义，颗粒直径在5 mm以下的塑料被称为微塑料。微塑料来源广泛，包括初级微塑料和次级微塑料，前者是指在生产制造时被直接加工成为直径小于5 mm的微塑料颗粒，而后者的微米级粒径源自大尺度塑料的碎片化。初级微塑料多见于日常清洁洗护用品，如洗面奶、牙膏等[2]。

我国长江、珠江以及东南沿海诸河流域等淡水环境中的水体、沉积物等多种环境介质均有微塑料存在的报道[3]。洞庭湖和洪湖水体中微塑料丰度分别为900～2 800和1 250～4 650 m-3[4]。太湖沉积物中微塑料丰度为11～234.6 kg-1[5]，而黄河流域沉积物中微塑料丰度为15～615 kg-1(干重)[6]。水体微塑料能通过摄食等多种途径对浮游生物、底栖生物和鱼类等水生生物的生长和繁殖产生不利影响。据报道，目前已有超过40种水生生物体内检出微塑料，被摄入体内的微塑料可以在不同组织间蓄积、迁移，导致行为能力、生长发育、代谢、生殖、氧化应激、免疫与炎症等方面的系列变化，诱发神经和基因毒性[7-12]。

河蟹，学名中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)，因营养丰富、口感鲜美受到消费者青睐，已成为我国主要的养殖蟹类，近年来公众对河蟹食品安全的关注度也越来越高。洪湖和监利是华中地区河蟹养殖的主产区，占据湖北河蟹养殖面积的80%以上[13]。以洪湖和监利不同养殖场的河蟹为研究对象，对其肌肉和肝胰腺组织中微塑料的含量及组成进行检测，结合养殖环境微塑料污染分析，研究结果可为养殖河蟹质量及环境安全评价提供参考，为水产品消费提供科学引导。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂及耗材

测试仪器包括显微共聚焦拉曼光谱仪(inVia，Renishaw，英国)、体式显微镜(BME Leica，瑞士)、密理博纯水仪(Milli-Q Advantage A10，美国)、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-Ⅲ，中国)。氢氧化钾(分析纯)购自国药化学试剂有限公司，使用时配制成w为9.09%的水溶液。无水氯化钠(分析纯)购自武汉中利源生物科技有限公司，用于配制NaCl饱和溶液，w为63%浓硝酸(分析纯)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。玻璃纤维素微孔滤膜(GF/C，直径47 mm，孔径1.2 μm，Whatman)。实验用水为自制Milli-Q超纯水。

1.2 样本采集

调查地点为湖北省洪湖市和监利市的5个养殖场，按序标记为C1～C5。分别于2020年8月和10月对养殖河蟹进行采集，依次记为批次Ⅰ和批次Ⅱ。具体采样步骤：每个养殖场随机选取大小一致的雌雄河蟹各10只。首先用吸水纸吸去体表水分，然后称重(精确到0.01 g)，测量并记录头胸甲长、额宽、体高、体质量等基本体征数据(表1)。用超纯水清洗河蟹体表，迅速取其肝胰腺和肌肉组织。将每个养殖场采得的河蟹组织(肝胰腺/肌肉)混样随机分为3份，锡箔纸包被，-40 ℃条件下保存备用。

表1 河蟹样本基本体征

利用采水器对5个养殖场的底层水进行采集(图1)。每个养殖场随机设置3个不同的取样位置，共采集15 L底层水样品，玻璃瓶密闭，4 ℃条件下保存备用[14]。同时，利用底泥采集器对底层沉积物进行采集。每个养殖场随机选取3个不同的取样位置，共采集1 kg沉积物样品，玻璃培养皿密封，-20 ℃条件下保存备用[14]。

图1 采样点分布示意

1.3 样品分析

利用真空冷冻干燥机对组织混样进行脱水，根据质量变化计算水分。采用碱解方法对河蟹肌肉与肝胰腺组织进行消解[15]，具体操作方法：将干燥的肝胰腺/肌肉组织粉碎，称取0.3 g冻干样品(对应鲜重为1 g)，于w=9.09%的KOH溶液中消化48 h以上，每2 h振荡烧杯1次。当溶液中无明显块状组织残渣时终止消化，所得消化液经过玻璃纤维素滤膜抽滤，滤膜60 ℃干燥过夜。滤膜使用前采取同样的干燥过夜处理，记录过滤前后质量变化，以计算样品消化效率，公式为

(1)

式(1)中，E为消解效率，%；m前为过滤前滤膜干质量，g；m后为过滤后滤膜与残留物干质量，g；M为组织样品干重，g。每个混样检测重复3次，每个养殖场共产生9个平行结果。

采用抽滤消解法从底层水样品中分离微塑料：每个底层水样品通过孔径为1.2 μm的玻璃纤维素滤膜，用10 mL KOH溶液将膜上所有物质全部冲洗至小烧杯中，40 ℃消化48 h后加入36 mLw=65%的HNO3溶液、4 mL超纯水，50 ℃加热30 min，以80 ℃超纯水按1∶2的比例稀释上述混合溶液。采用玻璃纤维滤膜对稀释后混合溶液进行抽滤，滤膜干燥过夜。若水样杂质较多，分多次处理。

采用密度浮选法分离底层沉积物样品中的微塑料：取200 g(湿重)底层沉积物置于烧杯中，加2 L饱和NaCl溶液，玻璃棒充分搅拌，锡纸密封静置24 h，取上层液体及悬浮物。再次加入2 L饱和NaCl溶液浮选，重复3次，合并收集所有上层液体及悬浮物，采用与水样相同的处理方法对其进行消解。分5次对每个养殖场的1 kg底层沉积物样品进行浮选、消解，得到的所有滤饼统一在显微镜下观察。

采用目视法鉴别微塑料。干燥后的滤膜经体式显微镜观察，根据外观、硬度、强度、韧性等物理特征挑选疑似微塑料样本，置于干燥洁净的载玻片上。用共聚焦拉曼显微镜对拣出样本进行观察、扫描，将得到的拉曼光谱与标准拉曼光谱比对，记录微塑料颗粒个数、形状、颜色、尺寸信息。

1.4 质量保证及控制

实验用蟹体经超纯水冲洗干净后，立即取样。实验人员全程穿戴棉质实验服及无粉丁腈手套，一切实验用具均事先经超纯水、无水乙醇冲洗干净。实验样品及溶液均由锡箔纸包被保存。实验全程采用玻璃仪器，并设置空白对照。在采样及取样现场设置环境空白对照，排除环境污染干扰。对肌肉及肝胰腺组织的消化效率设定在96%以上、镜下无明显生物组织及可降解杂质残留。

2 结果与分析

2.1 丰度

生物组织微塑料丰度常以g-1为单位[14]，表示每克生物组织(鲜重)中含有的微塑料颗粒数。然而由于混合体系中微塑料分布不均，不同检测平行之间偏差较大，故采用9 g检测平行检出的微塑料总数来表征相应采样养殖场河蟹微塑料污染程度，单位为(9 g)-1。同理，底层水丰度单位为(15 L)-1。底层沉积物丰度单位为kg-1[16]。

针对河蟹组织，选取肌肉和肝胰腺2个部位进行检测，分2个时间批次从5个采样点进行随机抽样检测。2个批次检测均显示，5个养殖场河蟹肌肉样本中未检出微塑料(结果未显示)。而肝胰腺组织结果较为复杂：批次Ⅰ的检测结果显示不同养殖场河蟹微塑料丰度大小顺序为：C4>C2=C3>C1=C5，其中C1和C5养殖场河蟹肝胰腺未检出微塑料(图2)。批次Ⅱ河蟹肝胰腺样本中仅C2养殖场检出微塑料。批次Ⅰ中C2、C3和C4养殖场的养殖河蟹肝胰腺微塑料丰度分别为6、6、9(9 g)-1，批次Ⅱ中C2养殖场河蟹肝胰腺微塑料丰度为12(9 g)-1。

图2 河蟹肝胰腺和水体MPs丰度

对底层水样品检测发现，仅有C4养殖场底层水检出微塑料，丰度为2(15 L)-1。而底层沉积物样品中未检出微塑料(结果未显示)。

2.2 微塑料污染特征

肝胰腺组织检测情况如下：5个养殖场批次Ⅰ45个肝胰腺平行样品中共分离得到270个微塑料样颗粒，经拉曼光谱扫描确认为微塑料的仅有21个(7.78%)，无机物粒子135个(50.00%)，其余114个(42.22%)为未知非塑料物体。批次Ⅱ45个肝胰腺平行样品中共分离得到660个微塑料样颗粒，经拉曼光谱扫描确认为微塑料的有12个(1.82%)，其余648个(98.18%)为未知非塑料物质。2个批次检出微塑料的化学组成有3种：聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、氟化乙烯丙烯共聚物(Teflon FEP)，对比检出PE微塑料拉曼光谱与标准拉曼光谱,如图3所示。在形态方面，碎片(72.73%)为河蟹肝胰腺组织样品中检出微塑料的主要类型，其余为颗粒(27.27%)。在样品中暂未发现任何纤维或泡沫状微塑料。河蟹肝胰腺组织样品中所有检出微塑料共有透明(36.37%)、红色(36.36%)、白色(27.27%)3种颜色，尺寸均为100～300 μm(结果未显示)。

肌肉组织检测情况如下：源自5个养殖场2个批次抽检河蟹的90个肌肉组织平行样品中共分离得到微塑料样颗粒279个，经消解、过滤、干燥、镜检、拉曼光谱扫描、比对等步骤检测，未发现存在微塑料(结果未显示)。

底层水样品检测情况如下：经过抽滤消解，从5个养殖场的75 L底层水中共分离得到228个疑似微塑料样本，其中2个疑似样本的共聚焦拉曼光谱的主要特征峰为1 061、1 127、1 293、1 438、2 846、2 880 cm-1，符合PE类塑料拉曼光谱吸收峰的特征[17]，其余样本均排除为塑料的可能性(图3)。2个PE微塑料的尺寸分别为336 μm×319 μm、217 μm×345 μm，外观分别显示为透明碎片和白色碎片(图4)。

图3 检出微塑料拉曼光谱与标准拉曼光谱对比

底层沉积物样品检测情况如下：采用密度浮选结合抽滤消解的方法，从5个养殖场的5 kg底层沉积物样品中共分离得到140个疑似微塑料样本，经共聚焦拉曼光谱仪扫描、比对，确认由底层沉积物分离的样本光谱均不符合塑料拉曼光谱特征(结果未显示)。

3 讨论

3.1 丰度

在环境介质及不同生物个体内，微塑料分布不均，针对养殖区域内河蟹个体的检测差异较大。且取样过程中存在组织摘取不完全等不可避免因素，对养殖河蟹个体检测、量化的方法并不能反映养殖区域内河蟹个体及环境的真实污染水平。另外，在相同养殖条件下，中华绒螯蟹雌雄个体生长速度存在差异，若采用个数/质量的丰度单位进行描述，体型差异可能导致结果解读出现歧义。为避免上述问题，在取样时特别选取体型接近性别群体平均水平的中华绒螯蟹若干(雌雄个体数目相等)，分别随机抽样产生该研究被检中华绒螯蟹雌雄个体。后采用摘取混样、多次重复的检测方式，最大限度降低个体差异，以比较群体间微塑料污染水平，研究结果未对雌雄个体进行区分表述。

A—红色片状微塑料，B—透明片状微塑料，C—白色片状微塑料，D—消解前底层水滤饼，E—消解后底层水滤饼。

5个养殖场中有3处的养殖河蟹体内存在微塑料污染，其中C2养殖场2个批次的河蟹肝胰腺组织均有微塑料检出，C4养殖场在批次Ⅰ河蟹肝胰腺组织中检出丰度最高，提示以上2个养殖场的养殖河蟹肝胰腺组织内微塑料污染高于其他养殖场。经统计换算，养殖河蟹肝胰腺组织内微塑料平均检出丰度为1.22 g-1，与其他物种相比，污染水平总体较低[18-21]。研究表明，舟山海域海岸环境中的海蟹体内微塑料平均丰度为(2.37±0.41) g-1(湿重)，陆源污染是海蟹污染的主要原因，说明海岸环境污染会对海蟹体内的微塑料赋存产生影响[18]。在长江中下游的21个水域内，每个蛤蜊体内存在0.4～5个微塑料，其赋存特征与其生活环境沉积物中微塑料的特征相似[19]。综上所述，环境微塑料丰度可以在一定程度上影响相应区域内水生生物体内的微塑料丰度[20-21]。

作为杂食性穴居或隐居甲壳类动物，中华绒螯蟹的生存环境介质主要包括底层水与底层沉积物。根据底层水检测结果，仅C4养殖场底层水中检出微塑料，该结果与养殖河蟹组织检测情况基本一致。根据单位统一换算，C4养殖场底层水微塑料检出丰度为0.13 L-1。文献调研发现，该养殖场底层水微塑料污染在淡水生态系统中处于较低水平[5]。各养殖场底层沉积物中均未检测到微塑料。对比发现，本次抽检养殖场内底层沉积物微塑料丰度低于底层水，这与前人多项研究结论相似。太湖沉积物中微塑料丰度为11～234.6 kg-1，低于水体微塑料丰度(3.4 × 103～25.8 × 103m-3)[5]。长江入海口水体微塑料丰度为231 m-3，而沉积物中微塑料丰度仅121 m-3[22-23]。大部分微塑料最终都会在生物附着或重力作用下沉降至沉积物[24]，但该研究抽检养殖场使用年限较短(<10 a)，且不定期进行清塘，沉积物中可检测尺寸范围内的微塑料未累积至检出丰度。另一方面，本次采样水域功能区定位为人工水产养殖区，有人员定期清理垃圾，水体及沉积物微塑料检测均受到人类活动影响。

微塑料进入养殖河蟹体内的方式为误食摄入，且塑料污染具有普遍性，综合考虑上述情况，饲料也是养殖河蟹微塑料污染的可能来源。据调研，本次被检养殖场均采用商业化饵料，然而由于养殖户改变养殖产品、频繁更换饵料等实际原因，未能取得相应饵料样品，饵料中微塑料污染情况有待今后进一步探讨。

综合河蟹组织、底层水、底层沉积物微塑料检出丰度，仅C4养殖场底层水中检出微塑料。C2、C3养殖场底层水样品中未检出微塑料，但河蟹肝胰腺组织中检测到微塑料，不定期的垃圾清理活动是其主要影响因素。

3.2 微塑料污染特征

外观形态差异是影响微塑料在生物体内蓄积、转移的重要因素[18]。来自长江河口、东海和南海，习性不同的鱼体内检出的微塑料和中等尺寸塑料的大小范围分别是0.04 ～5 mm和5.1 ～24.8 mm，<5 mm的粒子占所有检出塑料的七成以上(76.3%)，纤维是主要的类型，其次是碎片[25]。与此类似，本次抽检的2个批次河蟹肝胰腺组织中检出的微塑料以片状为主，仅有少部分为颗粒状样本，所有微塑料尺寸均为100 ～ 300 μm，颜色组成以透明和红色为主，其次是白色。针对养殖环境，仅C4养殖场底层水中检测到透明和白色片状微塑料，大小为200 ～ 350 μm。底层水及养殖河蟹肝胰腺组织内微塑料的外观特征具有颜色相近、尺寸不同的特点。该差异主要与河蟹对于食物样微塑料的选择性摄食及体内蓄积转移的尺寸限制有关。研究表明，某些浮游鱼类倾向于选择与食物相似的微塑料[26]。作为监测环境污染的指示物，贻贝(Mytilusedulis)体内微塑料与水体微塑料在尺寸分布上也有所差异(P<0.001)，贻贝更易于摄入小尺寸的微塑料[27]。实验室条件下扇贝(Placopectenmagellanicus)可对5、10、20 μm的微塑料进行选择，较大的粒子在扇贝胃中的保留时间更长[28]。然而还需要更多的研究来确定不同粒径微塑料在生物体内的行为。

河蟹肝胰腺组织中检出微塑料的化学组成包括聚苯乙烯(PS)、氟化乙烯丙烯共聚物(Teflon FEP)、聚乙烯(PE)3种常见塑料成分。养殖河蟹体内微塑料化学组成与其环境来源密切相关。来源于C4养殖场的河蟹肝胰腺组织中检出的微塑料化学组成均为PE，与底层水检出微塑料化学成分相同。根据已有研究，我国淡水环境中微塑料的化学组成主要是PE、聚丙乙烯(PP)以及PS[3]，原因与以上几种塑料在日常生活中的大量应用有关，这也与该研究检出结果基本一致。而Teflon FEP是各种电线和电缆的常用材料，该类型微塑料的检出符合养殖场水体环境调研情况。这进一步印证了人类活动、工业生产对于微塑料污染的重要影响[29]。

由于体积微小、水生生物难以分辨，微塑料常常成为食物网中滤食性、悬浮物和碎屑摄食者的误食目标[30]。经文献调研，在鱼类、海龟、海洋无脊椎动物及其他大型海洋动物的肠道中都检测到了微塑料[31]。基于生物体对所处环境微塑料污染的敏感性，某些特定的水生生物可被用作评价环境微塑料污染风险的指示生物，如蛤蜊被选为淡水沉积物微塑料污染的指示生物[19]。在淡水环境，微塑料主要分布在水体及沉积物中。由于强风、降水等因素，存在于各个环境介质中的微塑料可能不断迁移、扩散，其分布也呈现出空间异质性的特点[32]。然而关于微塑料分布的研究多基于表层水展开，不同深度水体数据资料不完善，制约了对微塑料迁移规律的探索。针对不同深度水体、不同介质，微塑料污染风险评估同样应使用不同的指示生物。对养殖河蟹与所处底层水、底层沉积物的检测分析表明，底层水与养殖河蟹肝胰腺组织内微塑料赋存有关联一致的特点。养殖河蟹微塑料污染可在一定程度上预警相应养殖场的底层水微塑料污染状况。

目前，水生生物体内的微塑料研究主要集中于消化系统。源自英吉利海峡10种海鱼的504个肠道样本中，有36.5%的样本检出微塑料[33]。此外，研究也证实在淡水和近海生物肠道中存在大量微塑料[34-35]。说明肠道作为重要的消化吸收器官，是微塑料累积的主要部位。除此之外，肌肉、皮肤、肝、鳃以及骨骼等组织也是微塑料可能的赋存场所[36]。该研究检测结果与文献相一致：肝胰腺微塑料整体赋存丰度大于肌肉，而产生这种差异的原因还有待深入研究。关于微塑料对水生生物的毒理研究表明，摄入微塑料将对个体存活、发育、行为、生殖、代谢、炎症反应、组织病变、基因表达等产生影响[11,30]。微塑料生产过程中所使用的化学添加剂、从环境所吸附的重金属及持久性有机污染物更是水生生物安全健康的重要威胁[37]。开展养殖水产品微塑料污染情况研究十分必要，然而迄今为止，关于养殖水域环境与水产品微塑料污染的研究报道仍然较少。

4 结论

研究表明，源自湖北省洪湖市和监利市5个养殖场的河蟹肌肉组织和底层沉积物中未检出微塑料。有3处养殖河蟹的肝胰腺组织内检测到微量微塑料(平均丰度1.22 g-1)，其主要成分为聚乙烯、聚苯乙烯和氟化乙烯丙烯共聚物。C4养殖场底层水中检出透明和白色片状聚乙烯2种微塑料(丰度0.13 L-1)，与养殖河蟹肝胰腺组织内的微塑料存在共性。以上研究结果表明，当前湖北河蟹养殖环境微塑料污染处于较低水平，河蟹微塑料污染风险安全可控。